《STAR Protocols》：Base editing rescues a hereditary motor neuron disease in mouse and patient-derived iPSC organoid models
编辑推荐：
在遗传性运动神经元疾病（MNDs）中，包括由单核苷酸变异引起的肌萎缩侧索硬化（ALS）亚型，有效的治疗策略需要同时针对功能获得和功能丧失机制。基于基因组编辑的基因治疗是同时靶向这些机制的一种有前景的方法。为了在遗传性MND中建立碱基编辑的概念验证，研究人员靶向
在遗传性运动神经元疾病（MNDs）中，包括由单核苷酸变异引起的肌萎缩侧索硬化（ALS）亚型，有效的治疗策略需要同时针对功能获得和功能丧失机制。基于基因组编辑的基因治疗是同时靶向这些机制的一种有前景的方法。为了在遗传性MND中建立碱基编辑的概念验证，研究人员靶向了TRK融合基因（TFG）中的P285L变异，该变异导致近端为主遗传性运动和感觉神经病（HMSN-P），这是一种与ALS具有共同临床和组织病理学特征的疾病。研究人员通过在HMSN-P患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）中比较候选编辑器，确定了最佳腺嘌呤碱基编辑器。随后，研究人员生成了表达人TFG P285L的转基因小鼠模型，并通过将腺相关病毒（AAV）载体软膜下递送至脊髓来评估所选编辑器。AAV介导的碱基编辑延长了生存期，保护了运动神经元，并减轻了腹侧神经根的轴突丢失。用所选碱基编辑载体处理可减少HMSN-P iPSC来源的神经肌肉类器官中的TFG聚集并抑制神经元死亡。总之，这些发现支持碱基编辑对遗传性MND的治疗潜力。
论文解读：碱基编辑在遗传性运动神经元疾病小鼠模型及患者iPSC类器官中的治疗潜力
运动神经元疾病（MNDs，一组以运动神经元进行性丢失为特征的致死性神经退行性疾病）包括肌萎缩侧索硬化（ALS）等多种类型，目前疾病修饰疗法极为有限。遗传性MND的罕见形式为探索跨疾病谱治疗策略提供了重要机会。遗传性运动感觉神经病伴近端优势受累（HMSN-P）是一种由TRK融合基因（TFG）P285L变异引起的常染色体显性MND，临床表现为成人起病的进行性近端肌无力，并最终出现延髓和呼吸受累。HMSN-P患者运动神经元中可观察到变异TFG的病理性聚集及TDP-43聚集，提示毒性功能获得机制；而TFG其他变异导致的Charcot-Marie-Tooth病和遗传性痉挛性截瘫则被认为与单倍剂量不足或功能丧失机制有关。因此，有效治疗需同时应对功能获得与功能丧失的双向致病机制。传统CRISPR-Cas9依赖双链DNA断裂并通过非同源末端连接或同源定向修复进行修复，在神经元等有丝分裂后细胞中精确修复效率低下且存在插入/缺失风险。碱基编辑（base editing，一种不产生DNA双链断裂的精准单核苷酸编辑技术）可在不引入双链断裂的情况下实现靶向碱基转换，为基因治疗提供了新可能。该研究发表于《STAR Protocols》，旨在开发AAV介导的腺嘌呤碱基编辑疗法，靶向纠正TFG P285L变异，并在HMSN-P小鼠模型和患者iPSC来源的神经肌肉类器官中验证其疗效。
研究人员从HMSN-P患者外周血单核细胞中重编程获得iPSC系，通过电穿孔导入编码候选腺嘌呤碱基编辑器（ABE7、sABE7、ABE8e）及sgRNA的质粒，结合下一代测序筛选最佳编辑器。构建了表达人TFG P285L的转基因小鼠（约20拷贝，prion启动子）。采用AAV9双载体split-intein系统递送ABE8e，经腰椎L3软膜下注射至成年小鼠脊髓。同时利用患者iPSC分化为含脊髓运动神经元的神经肌肉类器官，并对小鼠脊髓进行单细胞RNA测序（scRNA-seq，single-cell RNA sequencing）分析。健康对照iPSC系为201B7。
结果部分：
**筛选靶向TFG变异的最佳腺嘌呤碱基编辑器（In vitro screening of optimal ABEs targeting the TFG variant）**：通过比较三种ABE在HMSN-P患者iPSC中的编辑效率，NGS显示目标位点A-to-G转换效率分别约为10.2%、26.0%和78.0%，对应可编码野生型氨基酸的等位基因比例分别为55.1%、63.0%和89.0%，最终选择ABE8e。旁观者编辑很少，且预测脱靶位点深度测序未检测到脱靶编辑。
**HMSN-P模型小鼠的生成及体内碱基编辑纠正TFG变异（Generation of HMSN-P model mice and in vivo base editing to correct the TFG variant）**：转基因小鼠约8月龄出现进行性运动功能障碍，脊髓运动神经元进行性丢失、L4腹侧神经根轴突减少，并伴随胶质细胞活化。通过L3软膜下注射AAV9-ABE8e，靶向NGS显示脊髓组织平均编辑效率约4%，但AAV优先转导运动神经元（在ChAT阳性运动神经元中转导率为59.2%），提示组织平均编辑频率低估了靶细胞中的实际编辑水平。
**碱基编辑对HMSN-P模型小鼠疾病表型的疗效（Evaluating the efficacy of base editing on disease phenotypes in HMSN-P model mice）**：AAV治疗使疾病发病延迟（113.9±9.9天对119.5±8.9天），总生存期显著延长（393.2±7.7天对421.1±6.8天），转棒表现改善。11月龄时，AAV治疗减轻了腰髓ChAT阳性运动神经元丢失和L4腹侧神经根轴突减少，并缓解星形胶质细胞活化及小胶质细胞浸润，但未明显减少TFG蛋白聚集。
**单细胞转录组分析揭示碱基编辑调节小胶质细胞免疫应答（Single-cell transcriptomic analysis reveals modulation of microglial immune responses by base editing）**：对治疗1个月后的小鼠脊髓进行scRNA-seq，小胶质细胞表现出最强的疾病相关及治疗响应转录变化。Tg小鼠小胶质细胞中上调的68个基因在AAV治疗后显著下调，基因本体富集显示这些基因涉及抗原加工与呈递、干扰素相关及T细胞相关免疫通路，代表基因包括Cd74、B2m、H2-D1、H2-K1、Ifitm3和Cd274等，提示碱基编辑可部分逆转疾病相关的小胶质细胞免疫激活程序。
**碱基编辑在HMSN-P患者神经肌肉类器官中的疗效（Evaluating the efficacy of base editing in human neuromuscular organoids derived from an HMSN-P patient）**：患者来源类器官的神经元中TFG聚集显著增多，cleaved caspase-3阳性神经元比例升高。AAV介导的碱基编辑处理显著减少神经元内TFG puncta数量，并抑制神经元凋亡。
讨论部分指出，HMSN-P与ALS共享临床及病理特征；TFG在ER-高尔基体囊泡运输和蛋白质稳态中发挥作用，P285L变异导致毒性功能获得，而其他TFG变异与功能丧失有关，因此治疗策略应精确纠正致病变异而非抑制整体TFG表达。采用软膜下注射可将少量AAV直接递送至脊髓，可能降低背根神经节毒性，但需椎板切除等手术操作。本研究中编辑效率受限于模型鼠的高转基因拷贝数和双AAV split-intein系统的包装限制，但即使bulk组织编辑频率较低，仍可观察到治疗获益。旁观者编辑未改变TFG氨基酸序列，预测脱靶位点未检出功能性编辑。局限包括使用PBS作为对照，不能完全排除AAV载体自身的生物学效应；bulk组织编辑频率可能显著低估运动神经元中的实际编辑效率；未来需优化载体设计、启动子和递送策略。研究结论为：通过软膜下注射递送的AAV介导的腺嘌呤碱基编辑改善了HMSN-P小鼠模型和患者来源神经肌肉类器官中的疾病表型，这些发现为基于变异纠正的HMSN-P治疗提供了概念验证，并凸显了精准基因组编辑作为其他由致病性变异引起的遗传性MND治疗策略的潜力。
