盐生植物盐穗木miR172e/TOE3模块调控拟南芥对Pst DC3000和黄萎病菌的抗性

《Environmental and Experimental Botany》：The Halophyte Halostachys caspica miR172e/ TOE3 module regulates Arabidopsis resistance to Pst DC3000 and Verticillium dahlia

　　

•HcTOE3是来自盐生植物盐穗木(Halostachys caspica)的AP2/ERF转录因子，HcmiR172e/HcTOE3模块调控植物免疫。
•HcTOE3通过气孔防御、木质素化以及SA/JA信号传导增强拟南芥对Pst DC3000和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的抗性。
•HcTOE3可直接结合这些防御相关基因(AtPR1、AtPDF1.2、AtPR2和AtVSP2)的启动子，从而激活植物防御反应。
•HcmiR172e通过抑制HcTOE3的转录丰度负调控植物免疫。

盐生植物盐穗木miR172e/TOE3模块调控拟南芥抗病性的分子机制解读

**研究背景与科学问题**

植物作为固着生物，在自然生长过程中持续面临病原菌侵染等生物胁迫。丁香假单胞菌致病变种番茄DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst DC3000)是一种革兰氏阴性细菌病原体，已成为研究植物免疫应答的模式系统，可侵染番茄、大豆和烟草等多种经济作物。大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)则是一种土传维管束枯萎真菌，严重危害棉花等经济作物，在全球范围内造成重大产量损失。AP2/乙烯响应因子(APETALA2/Ethylene Responsive Factor，AP2/ERF)超家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育和多种环境胁迫响应中发挥关键调控作用。其中，AP2亚家族成员如TOE3已被证实参与非生物胁迫响应，但其在植物免疫中的功能仍不清楚。microRNA miR172是相对保守的miRNA家族，通过与AP2-like转录本互补序列配对，介导靶基因mRNA切割或翻译抑制。盐穗木(Halostachys caspica)是藜科盐生植物，自然分布于中亚高盐碱半荒漠地区，是研究植物胁迫适应机制的宝贵遗传资源。前期研究中，研究人员通过整合盐胁迫下盐穗木根部小RNA文库与转录组数据，鉴定出HcTOE3为HcmiR172e的潜在靶基因，并通过烟草瞬时表达实验和RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RLM-RACE)验证了HcmiR172e对HcTOE3的切割作用。然而，该模块是否参与植物免疫调控尚属未知。本研究旨在解析HcmiR172e/HcTOE3模块在拟南芥抵抗Pst DC3000和V. dahliae VD991侵染中的作用机制。

**主要技术方法**

研究人员利用qRT-PCR分析盐穗木和拟南芥中HcmiR172e、HcTOE3以及防御相关基因的表达水平；通过Pst DC3000喷雾接种和VD991根系浸泡接种进行病原菌处理；采用DAB、NBT和台盼蓝染色检测活性氧(reactive oxygen species，ROS)积累和细胞死亡；利用商业试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性；通过Imaging-PAM叶绿素荧光仪测定Fv/Fm、Y(II)、ETR、NPQ和Y(NO)等光合参数；采用显微镜观察并统计气孔开闭状态；利用乙酰溴法测定木质素含量；通过酵母单杂交(Y1H)和双荧光素酶(Dual-LUC)实验验证HcTOE3与靶基因启动子的直接结合及转录激活活性。供试植物材料包括野生型Col-0拟南芥、HcTOE3过表达系(OE2/OE3)和HcmiR172e过表达系(OE1/OE2)。

**研究结果**

*HcmiR172e/HcTOE3模块在生物胁迫下的表达模式*

对三个月龄盐穗木施加SA、MeJA、ET、6-BA激素处理以及Pst DC3000和VD991病原菌挑战后，qRT-PCR分析显示HcmiR172e表达水平持续下降，而HcTOE3转录本丰度显著升高，呈现典型的miRNA-靶基因反向调控关系，表明该模块可能参与盐穗木对生物胁迫的响应。

*HcTOE3增强拟南芥对Pst DC3000的抗性*

Pst DC3000喷雾接种后，HcTOE3过表达植株病害症状显著减轻，叶片保持相对健康状态；HcmiR172e过表达植株则出现严重黄化。细菌增殖定量分析显示，HcTOE3过表达植株叶片内细菌群体数量约为1.5×10² cfu，而HcmiR172e过表达植株高达约1000 cfu。表达分析表明，HcTOE3过表达植株中PR1、PR2、PR5、WRKY53、PDF1.2、VSP2和ERF104等防御相关基因的表达量在感染后显著高于Col-0，HcmiR172e过表达植株则相反。ROS检测显示，HcTOE3过表达植株在感染后表现出更强的H₂O₂和O₂^?积累，以及更显著的过敏性反应(hypersensitive response，HR)相关细胞死亡。抗氧化酶活性测定显示，HcTOE3过表达植株中SOD、POD和CAT活性显著增强，编码基因AtSOD2、AtPOD和AtCAT1的转录水平同步上调。光合参数测定显示，HcTOE3过表达植株在感染后维持较高的叶绿素含量、ETR和Y(II)，并表现出增强的NPQ和降低的Y(NO)，表明光合装置受损较轻。气孔分析表明，HcTOE3过表达植株在Pst DC3000处理1 h后表现出更强的气孔关闭反应，3 h后气孔虽有所重新开放，但仍显著高于Col-0的关闭程度。

*HcTOE3增强拟南芥对VD991的抗性*

VD991接种后，HcTOE3过表达植株在10 dpi时仅表现轻微黄化，HcmiR172e过表达植株则出现严重萎蔫和黄化，Col-0介于两者之间。病情指数分析显示，HcTOE3过表达植株的病指和叶片感染率显著低于Col-0，相对抗病效率提升约40%，且在18、21和25 dpi时死亡率持续低于Col-0。真菌恢复实验和生物量定量显示，HcTOE3过表达植株茎段真菌恢复率显著降低，根部真菌生物量积累减少。木质素含量测定发现，VD991感染后HcTOE3过表达植株根部木质素含量显著增加，苯丙烷代谢途径关键基因AtPAL4和AtC4H的表达同步上调。防御基因表达分析显示，HcTOE3过表达植株中PR1、PR2、PR5、PDF1.2、VSP2和PAD4等基因的表达水平显著升高，而HcmiR172e过表达植株中这些基因的表达受到抑制。

*HcTOE3直接结合并激活防御基因启动子*

生物信息学分析显示，AtPR1、AtPDF1.2、AtPR2和AtVSP2的启动子区域含有TTTGTT、AGCTA、GAGG和AACGG等推测的HcTOE3结合顺式元件。Y1H实验证实HcTOE3可直接结合这4个防御基因的启动子区域。Dual-LUC实验进一步证明，HcTOE3可显著增强这些启动子驱动的荧光素酶活性，表明HcTOE3是这些防御基因的直接转录激活因子。

**讨论与结论**

讨论部分指出，HcTOE3介导的抗病性与ROS的双重角色密切相关。感染早期，HcTOE3过表达促进ROS积累并诱导HR相关细胞死亡以限制病原体扩散；感染后期，抗氧化酶系统被强烈激活以清除过量ROS，维持细胞氧化还原稳态。光合性能的维持为免疫激活提供了能量和代谢资源。在激素信号层面，HcTOE3通过协调激活SA和JA两条免疫通路实现对不同生活型病原体的广谱抗性。木质素沉积作为结构屏障限制了V. dahliae在维管束中的定殖。气孔免疫作为第一道防线有效阻止了Pst DC3000的侵入。

研究结论可归纳为：第一，HcTOE3过表达通过促进病原菌诱导的ROS积累、增强抗氧化防御、维持光合稳定性、增强气孔免疫及激活下游防御基因表达，显著增强拟南芥对Pst DC3000的抗性。第二，HcTOE3过表达通过协调ROS稳态、光合保护、木质素沉积、限制病原定殖和激活防御基因，增强了对大丽轮枝菌VD991的抗性。第三，HcmiR172e在病原菌挑战期间负调控HcTOE3表达，HcmiR172e过表达植株对Pst DC3000和VD991均表现更敏感的相反表型。第四，HcTOE3直接结合并激活AtPR1、AtPR2、AtPDF1.2和AtVSP2启动子，整合SA和JA相关免疫反应以增强抗病性。该研究揭示了盐穗木miR172e/TOE3模块作为植物免疫调控重要组分的功能，拓展了对AP2亚家族转录因子介导生物胁迫抗性机制的认识，并为经济作物抗病性遗传改良提供了有价值的候选基因资源。该研究也存在一定局限性，例如未直接定量检测与VD991抗性相关的内源植物抗毒素水平，以及病原菌感染过程中内源SA和JA含量的动态变化仍有待进一步探究。