外源OPDA诱导的拟南芥气孔关闭由过氧化氢和Ca2+介导

《Environmental and Experimental Botany》：Exogenous OPDA-induced stomatal closure is mediated by hydrogen peroxide and Ca2?+ in Arabidopsis thaliana

　　

外源OPDA诱导的气孔关闭并不严格依赖于经典的ABA信号途径。OPDA触发的气孔关闭需要依赖RbohF的活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累以及胞外Ca²⁺内流。OPDA结合蛋白ROC4在保卫细胞ROS产生的上游发挥作用。OPDA激活了一个聚焦的保卫细胞转录程序，涉及NAC转录因子、氧化还原及胁迫相关基因。

论文解读：外源OPDA经ROC4、RbohF依赖的ROS产生和胞外Ca²⁺内流调控拟南芥气孔关闭

茉莉酸（jasmonic acid, JA）及其生物活性结合物茉莉酸-异亮氨酸（jasmonoyl-isoleucine, JA-Ile）是来源于脂质的oxylipin类信号分子，在植物防御、发育和胁迫适应中发挥重要作用。在经典JA生物合成途径中，JA由环戊烯酮12-氧代植物二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid, OPDA）在过氧化物酶体中经OPDA还原酶3（OPR3）和β-氧化转化生成。然而，越来越多的证据表明OPDA不仅是JA的前体，其本身也是一类独立的信号分子，参与种子休眠、胚胎发育和干旱适应等过程。已有报道显示OPDA可以诱导拟南芥等植物气孔关闭，但其下游信号传导机制仍不清楚。特别是OPDA是否必须依赖经典JA或脱落酸（abscisic acid, ABA）途径，以及其感知蛋白ROC4如何将信号传递至保卫细胞中的效应分子，此前尚未阐明。基于此，研究人员提出假说：OPDA诱导的气孔关闭涉及ROC4相关信号以及下游活性氧（reactive oxygen species, ROS）和Ca²⁺依赖事件。该研究通过遗传学、药理学、细胞学及转录组学方法系统解析了这一过程。研究结果揭示了外源OPDA在经典JA和ABA途径受损条件下仍能诱导气孔关闭，并且该过程依赖于RbohF介导的过氧化氢积累和胞外Ca²⁺内流，且ROC4位于ROS产生上游。该工作为理解OPDA调控气孔运动及植物水分利用效率提供了新的分子机制框架，论文发表于《Environmental and Experimental Botany》。

本研究采用的主要关键技术方法如下：以拟南芥Columbia（Col-0）和Landsberg erecta（Ler）为野生型，使用一系列相关突变体，包括JA合成及信号突变体（aos、opr3-3、opr2/3、coi1-30）、ABA相关突变体（nced3-2、aba2-1、pyr1/pyl1/2/4/5/8、abi1-1）、NADPH氧化酶突变体（rbohD、rbohF、rbohD/F）、蛋白激酶突变体cpk3/5/6/11、roc4突变体及35S::ROC4/roc4互补株系；突变体来源包括NASC及多个实验室共享。主要技术包括气孔开度显微测定、H₂DCF-DA荧光探针结合共聚焦显微镜检测保卫细胞H₂O₂，UPLC-MS/MS定量内源OPDA/JA/JA-Ile，以及RNA-seq和qRT-PCR转录组分析。

结果部分：

3.1 OPDA诱导的气孔关闭在JA和ABA相关突变体中的特征。研究人员通过不同浓度和时间处理确认10 μM OPDA处理1小时即可显著诱导野生型气孔关闭。在JA合成缺陷突变体aos、opr3-3、opr2/3以及JA受体突变体coi1-30中，OPDA仍能诱导与野生型相当的气孔关闭，说明该过程不严格依赖经典JA生物合成和COI1介导的JA信号。在ABA合成缺陷突变体nced3-2和aba2-1中，OPDA和ABA均能诱导关闭；而在ABA信号突变体pyr1/pyl1/2/4/5/8和abi1-1中，ABA失去诱导关闭能力，但OPDA依然有效。由此得出结论：外源OPDA诱导气孔关闭不严格需要经典JA途径和ABA核心信号途径。

3.2 RbohF是外源OPDA诱导H₂O₂积累和气孔关闭所必需的。利用H₂DCF-DA荧光探针检测保卫细胞H₂O₂，发现OPDA显著增加荧光信号。过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸（ASA）或NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理可完全消除OPDA诱导的H₂O₂积累和气孔关闭。在rbohD突变体中OPDA仍能诱导H₂O₂增加和关闭，而rbohF及rbohD/F双突变体中这些反应均被显著抑制。说明RbohF在OPDA诱导的ROS产生中起主要作用。

3.3 胞外Ca²⁺内流是外源OPDA诱导气孔关闭所必需的。用EGTA螯合胞外Ca²⁺或LaCl₃阻断质膜Ca²⁺通道后，OPDA诱导的气孔关闭被取消。在cpk3/5/6/11四突变体中，OPDA仍能诱导H₂O₂积累和气孔关闭，表明Ca²⁺内流是必需的，但CPK3/5/6/11这些钙依赖蛋白激酶并非必需。

3.4 ROC4作用于OPDA诱导气孔关闭过程中H₂O₂产生的上游。在roc4突变体中，OPDA既不能诱导H₂O₂积累，也不能诱导气孔关闭；而在35S::ROC4/roc4互补株系中，这两种反应均恢复。因此ROC4是OPDA信号通路中位于ROS产生上游的关键组分。

3.5 opr3/coi1-30双突变体对OPDA的转录响应。为避免外源OPDA被OPR3转化为JA进而激活COI1信号，研究人员在opr3/coi1-30双突变体背景下进行RNA-seq分析，采用冰匀浆法制备富含保卫细胞信号的表皮碎片。结果鉴定出17个上调、3个下调的差异表达基因。其中NAC转录因子基因ATAF1、ATAF2和ANAC102显著上调，氧化还原相关基因GSTU7、OXI1，解毒相关基因UGT73B3/B5、CYP81D8/CYP89A5，以及ABA转运蛋白ABCG40也被诱导。qRT-PCR验证与RNA-seq结果一致。这些结果说明OPDA可触发一个选择性的早期转录反应，但该反应并不完全等同于纯化保卫细胞的反应。

讨论与结论：该研究结果表明，外源OPDA诱导的气孔关闭在实验条件下不严格依赖经典JA和ABA途径，但并不能排除与ABA信号网络之间存在交叉调节。RbohF而非RbohD特异介导了OPDA诱导的ROS产生，这可能与质外体碱化及离子通道激活等下游事件有关。胞外Ca²⁺内流是OPDA信号所必需的，但CPK3/5/6/11不承担主要解码功能。ROC4可能通过影响细胞氧化还原状态参与信号传递，但其与RbohF之间的分子连接仍有待阐明。转录组分析鉴定的NAC转录因子和氧化还原/解毒相关基因为后续研究提供了候选因子。研究结论可翻译为：研究表明外源OPDA通过一种在测试条件下不严格需要经典JA和ABA途径的信号机制诱导气孔关闭。遗传和药理学分析表明，ROC4、RbohF依赖的过氧化氢积累和胞外Ca²⁺内流是OPDA诱导气孔关闭的重要组分。尽管这些组分之间的精确分子关系仍有待阐明，但结果支持一个模型，即ROC4相关信号与OPDA诱导气孔关闭过程中RbohF依赖的ROS产生和Ca²⁺内流相偶联。此外，对含有保卫细胞信号的冰匀浆表皮碎片的转录组分析揭示了一个对OPDA的选择性早期转录响应，其特征是NAC转录因子以及与氧化还原稳态、解毒和胁迫相关途径的基因被诱导。由于这些样品并非纯化的保卫细胞制剂，所识别的转录响应不能完全归因于保卫细胞。总之，这些发现建立了一个将OPDA信号与气孔调节中ROS产生、Ca²⁺信号和早期转录响应联系起来的机制框架，扩展了对OPDA介导气孔信号的理解，并为后续研究提供了潜在的分子组分。