《Fish & Shellfish Immunology》：Development and evaluation of a one-pot RPA-Cas12a assay based on a primer-driven reverse screening strategy for preliminary screening of megalocytivirus-related viruses
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•通过引物驱动的反向靶标筛选鉴定出ORF057L。•建立了一种单管冻干RPA–Cas12a检测方法。•该检测在测试范围内检测到了ISKNV、RSIV和TRBIV。•与MRV样本未观察到明显的交叉反应。•结果表明与qPCR具有初步的定性一致性。引言巨型细胞病毒（Megalocy
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通过引物驱动的反向靶标筛选鉴定出ORF057L。
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建立了一种单管冻干RPA–Cas12a检测方法。
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该检测在测试范围内检测到了ISKNV、RSIV和TRBIV。
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与MRV样本未观察到明显的交叉反应。
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结果表明与qPCR具有初步的定性一致性。
引言
巨型细胞病毒（Megalocytiviruses）属于虹彩病毒科（Iridoviridae），广泛分布于海洋和淡水养殖系统中。感染这些病毒与多种鱼类的高死亡率相关，并可能造成巨大的经济损失 [1,2]。传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、红鲷虹彩病毒（RSIV）和大菱鲆体色变红虹彩病毒（TRBIV）代表了巨型细胞病毒属（Megalocytivirus）内主要且高度相关的基因组群，在世界动物卫生组织（WOAH）近期关于诊断覆盖范围和疾病报告的讨论中被考虑在内 [3]。由于这些病毒在基因组水平上高度相关，仅凭临床症状无法实现可靠鉴定，实验室检测仍然至关重要。
分子检测仍是诊断的主要方法。虽然常规PCR很有用，但在分析敏感性和操作便捷性方面存在局限性 [4]。定量PCR（qPCR）提供了更高的分析敏感性，但依赖于专业仪器和实验室基础设施。已开发了用于检测ISKNV以及更广泛地检测三种ISKNV相关基因型的TaqMan qPCR检测方法，凸显了分子方法在监测和诊断中的重要性 [5]。等温扩增方法，如重组酶聚合酶扩增（RPA），能够在恒温条件下实现快速扩增，并已被应用于水产病原体的检测。然而，许多基于RPA的检测方法仍依赖于下游读取方法，如琼脂糖凝胶电泳或侧向流层析试纸条，这增加了操作步骤的数量，并可能增加污染风险 [6]。
近年来，RPA与CRISPR/Cas系统结合用于快速核酸检测。在识别靶标后，Cas12a对单链DNA报告分子表现出附带反式切割活性，从而将扩增产物转化为荧光或肉眼可见的信号 [7]。对于水产病原体，已报道了使用RPA–Cas12a或相关基于CRISPR的平台检测MRV/ISKNV、罗非鱼湖病毒、红点东星斑神经坏死病毒和大黄鱼虹彩病毒，证明了该策略在水产养殖诊断中的可行性 [[8], [9], [10]]。尽管如此，大多数现有检测方法都是针对预定义的保守基因设计的，如MCP、ORF007或ATP酶，通常仅针对单一病毒或特定基因型进行优化。
养殖中巨型细胞病毒相关病毒的遗传多样性凸显了对不依赖于预定义基因靶标且更能适应序列变异检测策略的需求。本研究采用了一种引物驱动的反向筛选策略。首先根据RPA扩增和Cas12a识别的技术要求设计候选检测单元，随后通过初步扩增评估和跨基因组回溯筛选确定其适用性和基因组位置。在此基础上，开发并评估了一种结合市售冻干RPA扩增模块的单管RPA–Cas12a检测方法，用于快速初步筛查巨型细胞病毒相关病毒。
章节摘要
样本、病原体及核酸制备
本研究使用了保存在我们实验室的巨型细胞病毒相关阳性样本、阴性鱼组织样本和非目标参考样本。阳性样本包括ISKNV、RSIV和TRBIV，均已通过qPCR确认为阳性。阴性样本由qPCR确认为巨型细胞病毒相关病毒阴性的鱼脑、脾脏和肾脏组织组成。包含一个MRV样本作为非目标参考以评估该方法。
引物驱动的反向筛选鉴定出ORF057L作为候选靶标区域
按照图1所示的引物驱动反向筛选工作流程，对根据ISKNV参考基因组NC_003494.1设计并在初步评估后保留的候选扩增单元进行了跨基因组适用性评估。在最初设计的五对候选RPA引物中，有四对在初次计算机模拟筛选中被排除，而一对引物被保留用于实验验证及随后针对75个完整基因组的回溯筛选。
讨论
本研究开发的结合市售冻干RPA模块的单管RPA–Cas12a检测方法应定位为巨型细胞病毒相关病毒的快速初步筛查方法，而非物种水平确认、病毒载量定量或基因分型工具。RPA能够在相对较低且恒定的温度下实现核酸扩增，从而减少了对热循环设备的依赖。先前的综述指出RPA通常。
伦理声明
本研究不涉及活体动物实验。本研究使用的核酸样本来自先前收集并保存的组织样本或实验室保存样本。所有实验程序均按照相关实验室规定进行，无需额外的伦理批准。
出版商声明
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资金支持
本工作得到河北省重大科技支撑计划（项目编号：252F2901D；专项计划：生物医药产业创新专项[生物制造]；项目名称：新型高效微生物复合环保制剂的开发与应用）和河北省科技计划（项目编号：25296601D；专项计划：国际科技合作/港澳台
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的相互竞争的经济利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文报告的工作。
Shuaiyu Jiang|Jingyu Zhang|Kuanjia Guo|Zhoutao Lu|Tiantian Chen|Tumenjargal Sharav|Susan Szathmary|Jichuan Chen|Weichen Sun|Alexei D. Zaberezhny|Yupeng Fang|Changjun Guo|Yongsheng Liu|Jie Zhang
