《Fungal Ecology》：Diversity of endophytic fungi in live and dead leaf sheaths of
Brachypodium sylvaticum infected with stroma-forming and asymptomatic
Epichlo? endosymbionts
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摘要Epichlo? 内生共生菌系统性地侵染禾本科植物的地上部分，以无症状内生菌或形成子座（束颈病）的状态存在。为研究形成子座的Epichlo?对非系统性内生菌的多样性和功能类群的影响，我们评估了形成子座（C+）或无症状感染（检测到Epichlo?，E+）的Brachypod
摘要
Epichlo? 内生共生菌系统性地侵染禾本科植物的地上部分，以无症状内生菌或形成子座（束颈病）的状态存在。为研究形成子座的Epichlo?对非系统性内生菌的多样性和功能类群的影响，我们评估了形成子座（C+）或无症状感染（检测到Epichlo?，E+）的Brachypodium sylvaticum活体和死亡叶鞘中的真菌多样性，并将其与未检测到Epichlo?的植物（E?）进行比较。形成子座植物中非系统性内生菌的丰富度显著高于无症状Epichlo?感染和未检测到Epichlo?的植物。三种感染类型和两种叶型之间非系统性内生菌的组成存在显著差异，其中对被归类为枯落物腐生菌的类群观察到显著的交互效应。这些发现表明，形成子座的Epichlo?促进了特定潜在病原菌和先锋枯落物腐生菌在存活叶鞘中的早期定殖，这可能改变叶衰老期间的初始真菌演替。未来的研究整合枯落物质量损失、胞外酶活性和致病性测定的直接测量，对于验证这些群落变化是否转化为枯落物分解动态的改变或宿主种群中病害发病率的变化至关重要。
引言
真菌内生菌定殖在健康的植物组织中并引起无症状感染，实际上定义为从表面灭菌的植物组织中分离出的真菌（Wilson, 1995, 2000）。内生菌与其宿主构成一个整体生物体，其中内生真菌对宿主的生长、健康和适应性做出贡献（Vandenkoornhuyse et al., 2015）。内生真菌群落的组装受到包括真菌物种间相互作用以及由宿主生理和形态特征介导的环境过滤等因素的影响（Saunders et al., 2010; Fukami, 2015）。了解主要共生菌或宿主状态如何改变植物内部生态位，对于阐明微生物群落组装的一般规律至关重要。在此框架下，内生真菌被分为系统性和非系统性内生菌（Sánchez Márquez et al., 2012）。
系统性内生菌被归类为Epichlo?属（Clavicipitaceae, Ascomycota），该属真菌侵染温带禾本科植物地上组织的内部。内生Epichlo?物种在宿主组织的细胞间隙中无症状生长，并通过种子进行垂直传播，通过促进生长以及提供非生物胁迫耐受性和抗取食者与病原体能力来提高宿主的适应性（Schardl et al., 1997）。内生Epichlo?物种的感染还会改变地下过程，如植物枯落物分解和土壤化学性质（Omacini et al., 2004; Gundel et al., 2016; Song et al., 2022）。除了无性繁殖外，一些Epichlo?物种还通过产生称为子座的外部孢子形成结构进行有性繁殖，这阻止了花序发育和宿主种子产生（已知为束颈病）（Clay and Schardl, 2002; Schardl et al., 2009）。子座形成不仅物理上改变了宿主表面，还诱导资源从宿主生长重新分配至真菌繁殖，这可能改变宿主植物的内部环境（White et al., 1997; Christensen et al., 2008）。Epichlo?真菌根据其繁殖方式的不同被分为三种类型（White, 1988; Clay and Schardl, 2002）。I型仅涉及通过释放子囊孢子进行子座形成的水平传播。II型既涉及通过子囊孢子进行子座形成的水平传播，也涉及通过种子的垂直传播。III型仅涉及通过种子的垂直传播而不形成子座。目前已报道了34种、6个亚种和3个变种Epichlo?；其中2种和1个亚种被归类为I型，9种和2个亚种为II型，23种、3个亚种和3个变种为III型（Leuchtmann et al., 2014; Tadych et al., 2014）。由于Epichlo?物种的有性繁殖对植物造成生态代价，系统性内生共生菌与其宿主禾草之间的相互作用可以描述为互利或寄生，这取决于真菌的繁殖方式（Clay, 1990; Meijer and Leuchtmann, 2000）。
与系统性Epichlo?内生共生菌不同，非系统性真菌内生菌在分类位置上具有多样性，且通常具有广泛的宿主范围，从禾本科植物到非禾本科植物（Sánchez Márquez et al., 2012）。非系统性内生菌在生态功能上也具有多样性，包括植物病原菌和枯落物腐生菌，可能是生态系统过程（如植物生产量、与取食者和病原体的相互作用以及分解）的重要驱动因素（Arnold, 2007; Saunders et al., 2010; Runnel et al., 2025）。最近的研究报道了无症状Epichlo?内生菌的存在影响了活叶和死叶中非系统性内生菌的组成（Nissinen et al., 2019; Mathew et al., 2023; Hatano et al., 2024）。然而，对于Epichlo?物种有性繁殖过程中形成外部子座的植物是否出现类似效应知之甚少。这种寄生性、形成子座的感染可能导致宿主在活叶和死叶中充当植物病原菌和枯落物腐生菌的生物过滤器。我们假设（i）形成子座的Epichlo?内生共生菌的存在与非系统性内生菌的丰富度和组成的变化不同于无症状感染的影响，（ii）这些效应不仅在活体植物组织中明显，在死亡组织中也存在，（iii）这些效应因非系统性内生菌的功能类群而异。
本研究的目的是调查Epichlo?感染类型（即形成子座与非形成子座的Epichlo?感染）对非系统性内生菌的多样性和功能的影响。在此背景下，我们选择了被Epichlo? sylvatica感染的Brachypodium sylvaticum（Leuchtmann and Schardl, 1998; Miwa et al., 2017）。Brachypodium sylvaticum是温带欧亚大陆和北非原生的多年生丛生草本植物。这种宿主禾草常见于树冠未完全闭合的地方，如林间空地或沿森林道路（Davies and Long, 1991; Meijer and Leuchtmann, 2000）。在Brachypodium sylvaticum和Epichlo? sylvatica的共生中，系统性内生菌（II型）的无性和有性繁殖在自然种群中发生的程度不同（Meijer and Leuchtmann, 2000）。我们采样了在日本共生生长的带有和不带有子座的B. sylvaticum活体和死亡叶鞘，并通过真菌内部转录间隔区1（ITS1）区域的DNA宏条形码技术评估真菌，以检测系统性内生共生菌并探索非系统性内生菌的丰富度、组成和功能类群。
章节片段
样本采集
Brachypodium sylvaticum的样本采集于2021年7月29日（花期），地点为日本中部长野县筑波大学须贺平山地研究中心（36°31′29″N, 138°20′48″E, 海拔1320米）。该地点年平均气温为6.6°C，年平均降水量为1342.9 mm（1981至2010年数据，须贺平山地研究中心记录）。我们在一个B. sylvaticum种群中建立了六个1 m × 1 m的研究样方，它们之间的距离均超过3米。在
分类和功能分配
来自252个样本的总计1,786,269条读段被分为1729个真菌OTU，序列相似性为97%。在1729个OTU中，905个OTU（52%）属于子囊菌门，533个OTU（31%）属于担子菌门，14个OTU（0.8%）属于毛霉门，2个OTU（0.1%）属于壶菌门，其余275个OTU（16%）未能分配到任何门（表S1）。关于各门的相对发生频率，广义线性混合模型（GLMMs）显示感染类型对子囊菌门的影响不显著。
讨论
在本研究中，我们展示了三种Epichlo?内生共生菌感染类型：形成子座（C+）、无症状Epichlo?感染（E+）和未检测到Epichlo?（E?），对Brachypodium sylvaticum活体和死亡叶鞘中非系统性内生菌的多样性和功能类群的影响。这些结果在很大程度上支持了我们关于非系统性内生菌的丰富度和组成受形成子座的Epichlo?存在的影响不同于无症状感染的假设。
结论
本研究展示了Epichlo?感染状态（形成子座与无症状Epichlo?感染）与Brachypodium sylvaticum中非系统性内生真菌的多样性相关。具体而言，外部子座的存在与活叶中OTU丰富度的增加以及非系统性真菌群落的显著组成变化相关。对于潜在植物病原菌和枯落物腐生菌，两者的组成分化
CRediT作者贡献声明
Yuki Hatano：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿撰写，指导，资源，方法学，调查，经费获取，形式化分析，数据管理，概念构思。Shunsuke Matsuoka：写作 – 审阅与编辑，资源，方法学，形式化分析。Ryunosuke Tateno：写作 – 审阅与编辑，资源。Takashi Osono：写作 – 审阅与编辑，指导，调查，概念构思。
资金
本研究由日本科学技术振兴机构SPRING，项目编号JPMJSP2129资助YH。
利益冲突声明
所有作者均无相关财务或非财务利益需要披露。
致谢
我们感谢须贺平山地研究中心提供研究地点的访问权限；感谢长谷川博士提供的有益讨论；感谢川崎先生在场务工作方面的协助。
Yuki Hatano｜Shunsuke Matsuoka｜Ryunosuke Tateno｜Takashi Osono
