靶位点选择与P1工程改造实现端到端自靶向剪接的高效环状RNA制备

《Nucleic Acids Research》：Target site selection and P1 engineering enable highly efficient circular RNA production via end-to-end self-targeting and splicing

　　

环状RNA（circular RNA，circRNA）比线性RNA更稳定，推动其在RNA疫苗与治疗领域的应用不断扩大。研究人员此前开发了一种基于四膜虫（Tetrahymena）I型内含子的端到端自靶向剪接（self-targeting and splicing，STS）体外circRNA制备方法，该方法可在不引入外源序列的情况下生成circRNA。然而，自环化效率随目标基因（gene of interest，GOI）长度增加而下降，限制了其在较长GOI中的应用。在本研究中，研究人员系统优化了STS效率的关键决定因素，包括靶位点选择与P1构建体工程改造。靶位点筛选结果表明，在每个GOI内选择最佳靶位点可显著提高自环化效率。此外，P1构建体的工程改造——包括在内含子内部导引序列（internal guide sequence，IGS）上游引入polyA₁₀序列，以及在polyA₁₀的5′侧引入与靶位点及其上游区域互补的反义序列——进一步提高了效率。值得注意的是，对于长GOI（约8 K-nt），优化后的STS策略实现的自环化效率比传统排列内含子-外显子（permuted intron–exon，PIE）方法高出一倍。综上所述，这些结果建立了一种改进的STS工作流程，可在广泛的GOI长度范围内高效制备无外源序列的circRNA，在长GOI上优于PIE方法，并拓宽了其生物医学应用前景。

环状RNA（circRNA）是共价闭合的RNA分子，因缺乏游离的5′和3′末端而能抵抗外切酶介导的降解，稳定性显著优于线性RNA，在疫苗、RNA编辑、嵌合抗原受体等生物医学领域应用日益广泛。传统体外circRNA制备的主流方法是排列内含子-外显子（PIE）法，但该方法会在最终circRNA产物中残留E1/E2片段（内含子疤痕）以及为提升效率而引入的间隔序列等外源序列，这些序列可能形成稳定分子内双链并诱发非预期免疫反应。自靶向剪接（STS）法利用四膜虫（Tetrahymena）I型内含子核酶，在体外转录（IVT）过程中通过端到端自靶向剪接将目标基因（GOI）的5′和3′末端连接，内含子完全释放，可产生与天然circRNA一致、无任何外源序列的产物。然而，自环化效率随GOI长度增加而下降，且迄今缺乏系统的效率优化策略，制约了长GOIcircRNA的规模化制备。为此，由Kyung Hyun Lee、Seongcheol Kim、Juwon Cha和Seong-Wook Lee组成的研究团队开展本研究，系统考察了靶位点选择与P1构建体工程对STS自环化效率的影响。该研究发表于《Nucleic Acids Research》。

研究采用的主要技术方法包括：利用gBlocks基因合成服务合成编码序列并克隆至pTOP载体构建P1及PIE质粒；以PCR制备T7 DNA模板；使用HiScribe T7 High Yield RNA合成试剂盒进行IVT；RNase R处理富集circRNA；采用4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE，适用于较小RNA）与