水解蛋壳膜-钙螯合复合物增强抗菌活性、抗氧化防御及雄性生殖稳态功能

《International Journal of Biological Macromolecules》：Hydrolyzed eggshell membrane–calcium chelation complex for enhanced antimicrobial activity, antioxidant defense, and male reproductive homeostasis function

　　

• 通过水解和络合反应开发的肽-Ca2+络合蛋壳膜（Eh-ESM–Ca）
• 水解提高了Eh-ESM–Ca的肽可及性、Ca2+结合力和溶解度
• 肽-Ca2+络合ESM能有效减少ROS并增强抗氧化防御
• Eh-ESM–Ca在应激条件下改善精子活力、运动能力和形态
• Eh-ESM–Ca在体内表现出良好的肝肾安全性和氧化还原平衡

引言
不孕症是一种多因素引起的医学状况，定义为夫妇在未采取避孕措施的情况下一年未能怀孕。根据世界卫生组织（WHO）的数据，男性不孕症约占此类病例的50%，并影响全球约六分之一的男性[1]。在过去的几十年中，据报道精子质量显著下降，精子数量、运动能力和形态的减少超过50%。这种下降的主要潜在原因之一是氧化应激，它破坏了精子功能所需的微妙氧化还原平衡[2]、[3]。活性氧（ROS）通过内在代谢过程和外在因素（如环境暴露、生活习惯和饮食缺乏）产生，直接损害精子膜、线粒体功能和DNA完整性，最终损害受精潜力。现代生活方式因素——包括营养不良、吸烟、饮酒、环境毒素和推迟生育——通过促进炎症、激素失衡以及莱迪希细胞和支持细胞的退化，进一步加重了氧化应激。尽管生理水平的ROS对正常精子功能是必需的，但过量的ROS积累会导致脂质过氧化、膜不稳定、线粒体功能障碍和精子DNA碎片化[4]、[5]。尽管对抗生素补充剂进行了广泛研究，但在保持系统安全性的同时实现有效的ROS调节仍然是生殖医学中的一个主要挑战。

目前治疗男性不孕症的主要策略包括激素治疗、营养补充和辅助生殖技术（ART），包括卵胞质内精子注射（ICSI）。尽管这些方法改善了临床结果，但它们未能充分恢复精子膜完整性或有效减轻氧化损伤[6]。此外，许多传统抗氧化制剂生物利用度差，难以透过血-睾丸屏障，且缺乏特异性生物活性，降低了其临床效果[7]。因此，开发能够同时调节氧化应激、增强生物利用度并保持系统生物相容性的多功能生物材料是非常理想的。

蛋壳膜（ESM）因其独特的组成和多效生物特性而成为一种有前景的天然生物材料。ESM是位于蛋壳和蛋清之间的富含蛋白质的纤维基质，主要由胶原蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和包括钙在内的微量矿物组成。它含有许多生物活性肽和富含半胱氨酸的蛋白质，具有抗氧化、抗炎和抗菌活性[8]。先前的研究表明了ESM在组织工程、伤口愈合、药物递送和生物传感方面的应用价值[9]、[10]。重要的是，酶水解可将高度交联的纤维基质转化为低分子量可溶性肽，暴露出反应性官能团并提高生物活性[11]。然而，ESM的生物性能强烈依赖于其结构状态。未水解的ESM（u-ESM）保留了紧凑的纤维结构，限制了活性官能团的可及性并限制了与生物系统的相互作用。尽管u-ESM天然含有钙，但其利用受限于溶解度差和生物利用度有限[12]。相比之下，酶水解产生富含暴露羧酸基（–COO?）和氨基（–NH?）的可溶性肽片段，从而改善生物相互作用和抗氧化活性。然而，内在钙含量的降低可能会限制钙依赖的生理功能。

传统的钙补充剂如碳酸钙和柠檬酸钙主要提供矿物质补充，而不具备额外的抗氧化或膜保护功能。最近，肽-矿物复合物引起了广泛关注，因为它们将矿物质递送与肽基质的生物活性结合在一起。然而，肽-Ca复合物和Eh-ESM肽在很大程度上是独立研究的，用于营养补充、钙生物利用度、骨再生或抗氧化应用。更重要的是，尚未有关于吸附型钙掺入和肽螯合型钙配位在ESM系统中的直接比较报告，特别是在生殖生物医学应用中。这一知识空白为本研究提供了科学基础。

钙（Ca2+）是一种重要的第二信使，调节精子运动、获能、超活化和顶体反应[13]、[14]。然而，由于其生物利用度有限和离子转运不受控制，其有效利用仍然具有挑战性。将Ca2+与生物活性肽基质配位代表了一种有前景的策略，以提高钙溶解度、调节其释放并增强生物活性。在Eh-ESM中，暴露的肽官能团与Ca2+离子易于配位形成稳定的肽-Ca复合物，而在u-ESM中，钙主要通过相对较弱的相互作用吸附在纤维表面。这些结构差异预计将显著影响其生物性能。除了生殖应用外，新开发的生物材料通常还会评估其抗菌和抗氧化性能，以确立其多功能生物医学潜力。精液处理、储存、冷冻保存和辅助生殖过程中的微生物污染可能会增加ROS产生、炎症反应、脂质过氧化、精子膜损伤、运动能力下降和DNA碎片化。因此，具有抗氧化和抗菌功能的生殖生物材料可能提供额外的保护，对抗微生物相关的氧化损伤。因此，所开发的ESM–Ca系统的抗菌活性作为其整体生物学表征的一部分进行了评估。此外，GC–MS分析鉴定了几种生物活性代谢物，包括氨基酸、脂肪酸和有机酸，这些可能有助于抗氧化防御、膜稳定和细胞稳态。这些多功能特性为在单一ESM–Ca生物材料平台内评估抗菌活性和精子保存提供了生物学依据。

本研究的核心假设是，酶水解是Eh-ESM–Ca增强生物性能的主要决定因素，因为水解增加了肽的可用性、溶解度和官能团的可及性，从而促进生物相互作用并促进随后的Ca2+配位。为了验证这一假设，采用了两层实验策略。首先，使用人类精子进行体外研究，评估氧化应激下的精子活力、运动能力、形态、DNA完整性和细胞内ROS调节。随后，在动物模型中进行体内研究，调查生殖参数、全身氧化还原稳态、肝肾功能和组织病理学变化。据我们所知，这是首次系统比较吸附型（u-ESM–Ca）和肽螯合型（Eh-ESM–Ca）系统在生殖生物医学应用中的研究。与先前报道的肽-Ca生物材料的比较见表S1（支持信息）。通过将天然来源的生物活性肽与配位的Ca2+离子相结合，本研究建立了一种具有抗菌、抗氧化、膜保护和生殖功能的多功能生物材料。这些发现为肽-Ca配位化学在设计男性生殖健康生物材料和未来辅助生殖技术中的作用提供了新的见解。

材料
未水解的蛋壳膜（u-ESM）由日本京都Foods Research Co., Ltd. 提供。此外，从泰米尔纳德邦维洛尔地区附近商店购买了生鸡蛋（用于收集蛋壳和膜）。蛋白酶K、0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和乙酸购自Sigma-Aldrich。氢氧化钠（NaOH）、氢氧化钾（KOH）、五氧化二磷（P?O?）和硅胶颗粒购自Fujifilm Wako Pure Chemical。

u-ESM–Ca和Eh-ESM–Ca系统的物理化学性质
使用FESEM、TEM、EDS和元素映射分析系统研究了u-ESM、u-ESM–Ca、Eh-ESM和Eh-ESM–Ca的形貌和表面特性（图1和支持信息中的图S1和S2）。原始的u-ESM呈现典型的纤维片状结构，直径约为3–5 μm，代表蛋壳膜的原生交联蛋白基质（图1b、b-1和b-2）。表面相对光滑和紧凑。

u-ESM-Ca和Eh-ESM-Ca系统的抗菌活性
使用琼脂打孔法评估了u-ESM–Ca和Eh-ESM–Ca复合材料对选定菌株的抗菌活性（图4，表2）。在两个系统之间观察到明显的抗菌性能差异。u-ESM–Ca复合材料在所有测试菌株中表现出微弱的抗菌活性，在较低浓度（10–30 μL）下未观察到抑菌圈，仅在40 μL时表现出最小抑菌作用。最大抑菌圈为...

结论
本研究通过酶水解成功开发了肽-Ca2+络合蛋壳膜系统（Eh-ESM–Ca），并与基于吸附的u-ESM–Ca进行了系统比较。结果清楚地表明，纤维状ESM向富含肽的基质的结构转变在增强钙相互作用、生物利用度和生物性能方面起着决定性作用。光谱和表面分析证实了稳定的肽-Ca2+配位复合物的形成。

作者贡献声明
Gopiraman Mayakrishnan：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法论，调查，正式分析，数据整理，概念化。Parameswari Ranganathan：撰写 – 原稿，验证，方法论，调查，正式分析，数据整理，概念化。Madhan Kumar Pichandi：可视化，验证，软件，资源。Muhammad Nauman Sarwar：可视化，验证，软件，资源。Kim Ick Soo：撰写 – 审阅与编辑...

伦理批准
本研究获得了机构伦理委员会批准（IEC No. 59/31/08/24）。精液分析根据WHO（2021）指南和Campbell等人（2021）的标准进行。所有参与者均获得了知情同意，并严格保密。动物实验遵循ARRIVE指南、英国《动物（科学程序）法》（1986年）和欧盟指令2010/63/EU。本研究还遵循委员会...

资金
本文基于由新能源和工业技术开发组织（NEDO）委托的项目JPNP 22021获得的结果。

未引用参考文献
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利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：Kim Ick Soo报告文章出版费用由新能源和工业技术开发组织提供设备、药物或供应。如果有其他作者，他们声明不存在已知的可能影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢
本工作由JSPS KAKENHI资助（项目编号24K15389）。P.R.感谢印度UGC的DSK博士后奖学金（编号F.4-2/2006（BSR）/BL/19-20/0246）以及印度泰米尔纳德邦泰卢瓦尔大学塞鲁卡杜分校生物技术部门的资助。

Gopiraman Mayakrishnan | Parameswari Ranganathan | Madhan Kumar Pichandi | Muhammad Nauman Sarwar | Kim Ick Soo