金属与聚合物辅助的蛋白质结合 DNA 分子扫描电子显微镜成像：一种方法

《Biology Methods and Protocols》：Metal- and polymer-assisted SEM imaging of protein-bound DNA molecules: a protocol

　　沿拉伸的长DNA分子直接绘制蛋白质的位置，需要同时可视化DNA骨架及其关联的蛋白质信号。我们近期建立了一种重金属与聚合物辅助的扫描电子显微镜（SEM）方法，用于对硅片上拉伸的DNA分子及其关联蛋白质信号成像。本文提出了一种实用方案，以λ DNA和链霉亲和素-荧光蛋白标记的λ DNA作为模型DNA样本，实现该工作流程的应用。该方案涵盖硅片制备、微通道引导的DNA沉积、使用UranyLess进行重金属染色、对沉积的DNA样本进行聚乙烯吡咯烷酮（PVP）处理、SEM成像以及图像分析。UranyLess提供重金属染色以增强SEM对比度，而PVP浓度则调节DNA骨架与蛋白质关联信号的相对可见性。低PVP条件有利于蛋白质信号的可视化，而高PVP条件则增强DNA骨架的成像效果。我们还描述了可选的通道内给药和基于液滴的UranyLess及PVP递送方法。最后，该方案涵盖了DNA骨架追踪、强度剖面分析以及基于机器学习的从SEM图像中确定蛋白质位置的方法。代表性的dCas9结合DNA样本进一步展示了该工作流程在不同蛋白质结合模式中的适用性，包括在重复靶标阵列上的紧密间隔结合以及基因组DNA上的局域结合。该工作流程为在硅片上制备拉伸的DNA样本，并通过SEM分析DNA骨架及其关联蛋白质信号提供了一个实用框架。