水稻白化致死突变体wll2的基因克隆与功能研究

　　

摘要：

【目的】探究甲基赤藓糖醇磷酸途径（methylerythritol phosphate，MEP）关键基因对叶绿体发育、叶绿素合成和幼苗生长的调控机制，阐明水稻叶色突变体白化致死的分子机理，为水稻光合机制解析与高光效种质创新提供理论依据。【方法】以野生型武运粳8号和白化致死突变体wll2（white leaf and lethal 2）为研究对象，综合运用色素测定、透射电镜技术、MutMap+、CRISPR-Cas9基因编辑技术、qRT-PCR技术、烟草瞬时表达、转录组测序分析和Western blot等分子生物学手段克隆目的基因并解析其功能。【结果】wll2从种子萌发开始即出现明显的叶片白化表型，且持续稳定，直至幼苗生长至四叶期死亡。wll2幼苗生长受到严重抑制，其苗长和根长显著低于野生型。与野生型相比，wll2的叶绿素a和叶绿素b含量显著降低，其叶肉细胞中叶绿体数量显著减少，内部类囊体片层数量减少、排列紊乱。利用MutMap+和基因编辑技术，确定导致叶片白化表型的基因为MEP萜类合成途径中的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因OsDXS1。qRT-PCR分析结果表明，OsDXS1在水稻不同组织中均有表达，其中，在叶片中的表达量最高，显著高于根、茎、叶鞘和幼穗。烟草瞬时表达试验显示，OsDXS1编码蛋白的荧光信号与叶绿体自发荧光完全重叠，证实其定位于叶绿体，与其参与MEP途径的功能相符。转录组测序共鉴定出7 197个差异表达基因（DEGs），其中，上调基因4 055个、下调基因3 142个。进一步GO与KEGG富集分析表明，下调DEGs主要富集于光合作用、质体功能和相关代谢通路，而上调DEGs聚焦于细胞周期、DNA代谢、核酸复制、物质代谢重塑和损伤修复等适应性响应通路。Western blot检测显示，光合系统Ⅱ核心蛋白PsbE和PsbO、光系统Ⅰ核心蛋白PsaA，以及光捕获复合体组分LHCa1的含量均显著降低。【结论】水稻白化致死突变体wll2的突变基因为MEP途径关键基因OsDXS1，该基因功能缺失会导致叶绿素合成受阻、叶绿体发育异常并引发白化致死。