引言
手性羟基羧酸是合成药物、天然产物和精细化学品不可或缺的手性砌块[1], [2], [3], [4], [5]。尽管不对称催化在实验室规模上已取得显著进展，但其工业应用往往受到贵金属催化剂依赖、苛刻反应条件以及产品分离困难等方面的限制[6]。酶催化凭借其卓越的立体选择性、温和的反应条件和优异的生物相容性，已成为绿色合成的关键策略[7]。然而，酶固有的脆弱性使其在苛刻的实际条件下易发生变性或失稳，导致使用寿命缩短且成本过高[8]。在连续生产过程中，这一问题尤为突出，酶稳定性差且难以从反应混合物中分离和再利用，严重制约了其应用[9], [10], [11]。因此，开发高产、可规模化的手性羟基酸生产策略仍是一项关键而紧迫的挑战[12], [13]。将多酶级联系统与先进的酶固定化技术相结合，正日益受到关注，被视为克服这些障碍的有前景的方法[14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]。
金属有机框架（MOFs）具有良好的生物相容性，在酶固定化领域展现出广阔的应用前景[21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]。一些研究人员开发了一锅包埋策略，将大分子酶固定化于窄孔MOF中[28], [29], [30], [31], [32], [33]。该方法实现了MOF制备过程中的同时成核与结晶，以及在单一反应体系内完成酶固定化，也被称为"原位包埋"策略[34], [35], [36]。沸石咪唑酯骨架材料（ZIFs），如ZIF-8、ZIF-67和ZIF-90，作为优异的微孔材料，适用于原位嵌入，其微孔结构可防止酶渗漏并减少在苛刻条件下的活性损失[37], [38], [39]。此外，对于辅酶依赖的酶促反应，微孔MOF包埋可实现辅酶与酶的同时固定化。该方法不仅避免了辅酶穿透固定化颗粒外壳时遇到的较大传质阻力，还防止了辅酶的渗漏和损失[40], [41], [42], [43]。然而，固定化颗粒的外壳不可避免地使底物与酶活性位点的结合更加困难。颗粒过大将增加传质阻力，影响反应速率[44], [45], [46], [47], [48]。反之，颗粒过小则可能无法完全包埋某些蛋白质，从而降低酶的负载量并削弱包埋过程所提供的保护作用[49], [50], [51], [52]。因此，实现对特定尺寸固定化酶颗粒的可控合成同样至关重要。
醇脱氢酶（ADHs）作为不对称合成的绿色可持续生物催化剂，受到了广泛关注[53], [54]。从假单胞菌（Pb）中获得的NADH依赖性短链脱氢酶（PbADH）凭借其高效合成结构多样的(R)型醇的能力，展现出优异的底物宽容性和工业潜力[55]。与此同时，脂肪酶催化的对映选择性酯化反应是一种成熟的生物转化策略[56], [57]。本文提出了一种基于两步酶级联反应的手性羟基羧酸连续生物制造平台。该集成系统以乙酰乙酸乙酯（EAA）为模型底物，结合PbADH的还原活性与Novozym 435脂肪酶的酯化能力，实现高效转化。值得注意的是，PbADH与NADH被原位共同固定化于亲水性ZIF结构中。通过优化辅酶共固定化和粒径，显著降低了内扩散阻力，从而增强了催化活性。此外，通过对包埋机制的综合分析与模拟，阐明了不同骨架结构对蛋白质构象的影响。该两步级联反应在微流控反应器中的实施，最终实现了(R)-3-羟基丁酸[(R)-3HB]的连续流合成，证明了该方法在手性羟基羧酸可规模化生物催化生产中的可行性。
