《Metabolic Engineering》：Genome-scale overexpression screening identifies product tolerance and efflux transport as key determinants of high-level L-tryptophan production in
Escherichia coli
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•开发了一种基于靛蓝的高通量报告系统，并结合基因组尺度过表达文库筛选鉴定了关键靶点。•soxS被鉴定为一个关键的耐受性靶点，其通过上调lpxC增强脂多糖合成，从而提高对L-色氨酸的耐受性。•鉴定了关键靶点yicL，YicL被表征为一种参与L-色氨酸运输的跨膜蛋白，可提高L-色
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开发了一种基于靛蓝的高通量报告系统，并结合基因组尺度过表达文库筛选鉴定了关键靶点。
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soxS被鉴定为一个关键的耐受性靶点，其通过上调lpxC增强脂多糖合成，从而提高对L-色氨酸的耐受性。
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鉴定了关键靶点yicL，YicL被表征为一种参与L-色氨酸运输的跨膜蛋白，可提高L-色氨酸产量。
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实现了目前报道的最高L-色氨酸微生物发酵标题度（70.4 g/L）和得率（0.25 g/g）。
引言
L-色氨酸是人和动物的必需芳香族氨基酸，在医药、食品和饲料工业中具有广泛的应用，具有巨大的经济价值（Hu等，2025；Seo和Kwon，2023；Xue等，2023）。随着L-色氨酸及其衍生物在医疗和食品相关领域应用认识的不断提高（Arabia等，2025），市场需求持续增长。因此，亟需能够高效工业化生产L-色氨酸的微生物细胞工厂来满足这一不断增长的需求。
然而，L-色氨酸的生物合成受到复杂代谢调控网络的限制，构建高产菌株仍然面临多项挑战：(1) L-色氨酸合成途径中的关键限速酶受到严格的反馈抑制（Dai等，2026）；蚁甲酰合成酶受L-色氨酸的反馈抑制（Pabst等，1973），DAHP合成酶受芳香族氨基酸的反馈抑制（Sprenger，2007）；(2) L-色氨酸的生物合成受多个调控层次的严格控制，包括trpR介导的转录抑制和trpL介导的转录衰减，这些调控机制限制了目标途径的持续高水平表达（Lee和Wendisch，2017；Merino等，2008）；(3) L-色氨酸的生物合成依赖于多种前体，包括PEP、E4P、丝氨酸和谷氨酰胺，细胞生长与产物形成之间的竞争可能源于前体供应不足或通量分配失衡（Gosset，2005；Li等，2020；Patnaik和Liao，1994）；(4) L-色氨酸合成途径相对较长，嵌入复杂的代谢调控网络中，这表明可能仍存在尚未鉴定到的影响L-色氨酸高效合成的关键因子（Liu等，2019）；(5) L-色氨酸及其衍生物含有吲哚环结构，可通过疏水相互作用破坏细胞膜完整性，从而降低细胞活力（Chen等，2011；Li等，2025）。
为应对这些挑战，已开发了多种代谢工程策略以提高L-色氨酸的生物合成效率。(1) 通过引入反馈抑制抗性突变体来缓解关键酶的反馈抑制。例如，将蚁甲酰合成酶突变为trpES40F后，L-色氨酸产量比trpEWT提高了36倍，达到2.14 g/L（Chen和Zeng，2017）；将DAHP合成酶突变为aroGS180F后，L-色氨酸产量提高了13.2%，达到3.94 g/L（Tang等，2023）。(2) 通过删除trpR和trpL来解除转录抑制和衰减。例如，删除trpR后，L-色氨酸衍生物靛玉红的产量提高了12.5%（Du等，2018）。(3) 通过增强前体合成和精细调节前体通量来解决前体供应不足和比例失衡的问题，特别是PEP和E4P的比例。例如，过表达ppsA和tktA以及删除pykAF或ppc已被用于增加PEP或E4P的供应，并将更多碳通量导入莽草酸途径（Lee等，2017；Liu等，2017；Shen等，2012）。此外，通过启动子工程微调PEP和E4P的供应比例，L-色氨酸产量提高了9.9%，达到33.2 g/L（Guo等，2022）。(4) 通过生物传感器辅助的突变筛选和多组学分析鉴定新型调控靶点。例如，通过突变筛选和转录组筛选鉴定到转录因子YihL，其为E. coli中L-色氨酸生物合成的负调控因子，删除yihL后L-色氨酸产量提高了16.3%，达到6.56 g/L（Tang等，2023）。(5) 通过适应性实验室进化提高菌株耐受性，该方法已被证明可有效增强生产芳香族化学品菌株的耐受性。例如，在原儿茶酸生产中，通过适应性实验室进化获得的耐受菌株将细胞死亡率降低了40.6%，产量提高了20.3%（Wang等，2024）。基于这些代谢工程策略，工程菌株的L-色氨酸生物合成能力得到了显著提升。在E. coli中，L-色氨酸的标题度、得率和生产率分别达到41.7 g/L、0.23 g/g和1.04 g/L/h（Liu等，2023）。在Corynebacterium glutamicum中，对应的标题度、得率和生产率分别达到50.5 g/L、0.17 g/g和1.05 g/L/h（Dong和Chen，2025）。与C. glutamicum相比，E. coli具有更高的L-色氨酸得率、成熟的遗传工具包、高效的基因组编辑系统以及全面的基因组功能资源，使其成为系统性代谢工程的更理想底盘。尽管如此，关键前体供应不足以及高浓度L-色氨酸引起的细胞毒性仍然限制了L-色氨酸产量的进一步提升。
在本研究中，首先通过模块化代谢工程强化了前体供应。为提高菌株耐受性，通过基因组尺度过表达文库筛选鉴定到soxS为关键靶点。机理分析表明，soxS通过调控lpxC增强脂多糖（LPS）合成，从而提高菌株耐受性。此外，鉴定到YicL为一种参与L-色氨酸运输的新型跨膜蛋白，并证明其可促进产物外排。综合这些工程策略构建了菌株TRPJ-28。经过发酵优化后，TRPJ-28在5 L生物反应器中生产了74.3 g/L L-色氨酸，得率为0.26 g/g，生产率为1.24 g/L/h。在1000 L中试发酵中，该菌株保持了稳健的生产性能，L-色氨酸产量达到70.4 g/L，得率为0.25 g/g，生产率为1.17 g/L/h。据我们所知，这是目前报道的微生物生产L-色氨酸的最高标题度。
章节摘要
菌株和引物
本研究使用的菌株、质粒和引物列于附表S1和S3。此前构建并实验室保存的大肠杆菌菌株TRPJ-0用作L-色氨酸生产的宿主菌株，E. coli DH5α用作质粒构建的克隆宿主。采用CRISPR-Cas9系统对工程化大肠杆菌的基因组进行高效操作。LB培养基用于DNA操作相关的大肠杆菌培养。氨苄青霉素（100 mg/L）、卡那霉素
通过模块化代谢工程提高L-色氨酸生物合成效率
为构建高性能的L-色氨酸生产菌株，以实验室保存菌株TRPJ-0作为起始底盘。在5 L生物反应器中发酵60 h后，菌株TRPJ-0生产了43.9 g/L L-色氨酸，得率为0.16 g/g，生产率为0.73 g/L/h。乙酸是主要的发酵副产物，达到0.22 g/L。这一相对较低的浓度表明乙酸积累不是限制L-色氨酸生产的主要因素（图2C）。
为
讨论
系统性代谢工程是构建微生物细胞工厂的有效策略。在本研究中，构建了一种基于靛蓝的报告系统，并与基因组尺度过表达文库筛选相结合，鉴定出soxS和yicL为提高L-色氨酸产量的关键靶点。机理分析表明，soxS通过调控lpxC的表达增强脂多糖（LPS）的生物合成，从而降低外膜通透性并
CRediT作者贡献声明
华平 Jia：方法学、调查。志善 Wang：方法学、调查。爱英 Wei：方法学、调查。春光 Zhao：方法学、调查。刚 Meng：方法学、调查。梦云 Xu：方法学。强 Zhou：形式分析。宇辰 Jiang：撰写——原稿、方法学、调查。黎明 Liu：撰写——审阅与编辑、验证、监督、经费获取、概念化。佳 Liu：方法学、调查、形式分析，
未引用文献
Grant等，1996；Henard等，。
致谢
本工作得到了科技重大项目（江苏省，BG2025045）、国家自然科学基金区域联合基金（U25A20618）以及宁夏回族自治区国家重点研发计划（2025BEE02002）的支持。
宇辰 Jiang|强 Zhou|梦云 Xu|刚 Meng|春光 Zhao|爱英 Wei|志善 Wang|华平 Jia|杰 Yang|佳 Liu|黎明 Liu
