通过合成无膜细胞器实现转录后调控的工程化

《Metabolic Engineering》：Engineering post-transcriptional regulation via synthetic membraneless organelles

　　

• •
  合成无膜细胞器可实现对mRNA的程序化空间控制，用于转录后调控。
• •
  模块化支架系统通过增强或隔离细菌中的靶标转录本调控代谢途径。
• •
  通过凝聚体介导的细胞分裂抑制蛋白mRNA的隔离，可恢复细菌细胞分裂。
• •
  工程化凝聚体通过区室化关键代谢酶mRNA来提高高价值代谢物的产量。

引言

生物分子凝聚体，也称为无膜细胞器（MLOs），是通过液-液相分离（LLPS）形成的动态亚细胞区室（Alberti and Hyman, 2021; Banani et al., 2017）。这些分子聚集体使生物分子——如蛋白质、RNA和DNA——能够在不依赖脂质膜的情况下进行空间组织，从而以惊人的时空精度促进复杂生化反应的调控（Garabedian et al., 2021; Pei et al., 2024）。在合成生物学领域，MLOs最近已成为提高途径效率的可编程代谢支架（Wan et al., 2023; Yu et al., 2024; Zhou et al., 2023）。通过将酶招募到凝聚体中，合成生物学家已实现了底物通道的促进、代谢交叉的限制以及目标代谢物生产滴度的提高（Hilditch et al., 2023; Kang et al., 2025; Qian et al., 2022）。这种浓缩和组织反应组分的能力使MLOs成为工程化细胞代谢的有前景平台（Dai et al., 2023b; Lee et al., 2025; Wan et al., 2024）。

MLOs创造隔离但可渗透的微环境，在浓缩生化反应的同时保持与宿主胞质内固有代谢过程的正交性（Nie et al., 2025; Reinkemeier et al., 2019）。这种区室化在代谢工程中尤为有利，因为它最小化了对内源途径的非预期交叉作用，并允许对合成回路进行控制。合成MLOs的传统应用主要集中于翻译后调控，例如共定位酶以增加反应动力学和特异性、促进底物通道以及减轻中间产物的细胞毒性（Wan et al., 2024; Yu et al., 2024）。例如，已在E. coli中工程化的功能性MLOs被证明能使靛蓝产量提高约2.3倍（Hilditch et al., 2023）。同样，在S. cerevisiae中，尺寸可调的MLOs使甲醇和苹果酸滴度分别提高了162%和61%；而动态控制的MLOs有效抑制了氧化糖酵解中的分支途径，使CO₂释放减少35%，并使丁醇产量提高20%（Zhou et al., 2023）。这些成功事例凸显了MLOs在翻译后水平优化代谢方面的实用性和多用途性。

通过合成MLOs进行翻译后调控的核心策略涉及将酶共定位到工程化区室中，以加速催化周转、稳定中间产物或减轻细胞毒性效应（Lim and Clark, 2024; Mu et al., 2021; Smokers et al., 2024）。然而，MLOs在转录后水平调控基因表达的巨大潜力——通过mRNA隔离、稳定性控制或翻译调节等机制——在很大程度上仍未被探索。这一差距限制了充分利用MLOs对基因表达和细胞工程进行多维控制的能力。

转录后调控构成了合成生物学中基因控制的关键层次，直接或间接地调控着蛋白质合成速率和代谢通量。构建一个用于此目的的稳健、可编程平台需要RNA结合蛋白（RBPs）及其对应适体——这些模块可以被设计用于特定的mRNA靶向和可调节的翻译控制（Hentze et al., 2018; Yi and Yan, 2025）。然而，这些工具的一个显著限制是它们在稀释的胞质环境中运作，其中低局部浓度和无约束扩散往往损害其效能。将这些转录后调控因子整合到空间组织的MLOs中提出了一种有吸引力的策略，通过创建高密度反应中心来克服这些挑战，以实现预期的mRNA控制。

鉴于这种潜力，我们提出工程化MLOs可以作为转录后调控的模块化平台，通过与RBP-适体系统整合来选择性富集凝聚体中的靶标mRNAs。这种空间隔离增强了局部分子浓度，并便于对翻译进行可调节控制——增强或抑制蛋白质合成——具体取决于凝聚体的物理化学性质和翻译机器的可用性。例如，虽然合成凝聚体可以通过特定RBPs招募mRNAs，但仅仅定位转录本而不协调对必要翻译资源和组分的访问可能会减弱翻译输出（Shapiro et al., 2025）。

在此背景下，本研究旨在通过开发能够通过RBP-适体相互作用招募靶标mRNAs以控制翻译过程的合成MLOs，弥合凝聚体工程学与转录后调控之间的差距。我们的研究专注于基于三种代表性蛋白质支架——源自PopZ的FUSN、RGG和ZH3——设计可编程凝聚体，每种都与正交的RBP-适体系统偶联以指导mRNA定位。在该系统中，RBP融合支架隔离适体标记的mRNAs，将转录本从胞质相互作用网络中空间隔离。随后与翻译起始因子共凝聚增强了被招募mRNAs的翻译，提供了一种调控代谢通量和细胞过程的手段。作为概念验证，我们将该平台应用于通过隔离细胞分裂抑制mRNA来恢复异常的细菌分裂，并通过增强靶标途径通量或限制中心代谢竞争来优化高价值代谢物——包括LNT（乳-N-四糖）和LNnT（乳-N-新四糖）——的合成。总之，这项工作通过在有源MLOs中整合转录后控制，开辟了一条重新编程基因表达的新途径，为重新编程基因表达和细胞过程提供了新的视角，对合成生物学具有广泛意义。

章节片段

菌株和质粒

本研究中使用的所有菌株、质粒、氨基酸序列和适体DNA序列列在补充表1-6中。重组质粒的构建和传播在E. coli JM109中进行。BL21(DE3)用于重组蛋白的表达和纯化，以及进一步用于共聚焦荧光成像。我们实验室储存的EN1菌株被用作合成所需产品的底盘细胞（Li et al., 2021; Li et al., 2022）。

对于

通过翻译起始因子和RBP-适体对优化翻译效率

在大肠杆菌（Escherichia coli）中，遗传信息从mRNA流向蛋白质是基因表达中的基本过程，涉及多种机器的协同作用，如核糖体、tRNA合成酶、翻译因子、tRNA和氨基酸（Metelev et al., 2022; Xu et al., 2020）。在此过程中，细菌通常采用三种翻译起始因子——IF1、IF2和IF3——以促进起始阶段（Webster et al., 2024）。值得注意的是，最近的证据强调

讨论

本研究建立了一个稳健且模块化的平台，用于在细菌中工程化合成MLOs，实现对mRNA定位和翻译的程序化空间控制。通过利用特定的RNA结合对，我们将合成凝聚体的功能谱扩展到了转录后调控这一关键但尚未充分探索的领域，超越了已确立的转录调控和翻译后代谢组织范式。

这个新兴领域

CRediT作者贡献声明

Ke Juntao：撰写-审阅与编辑，撰写-原始草稿，方法学，调查，正式分析，数据整理，概念化。Mu Wanmeng：监督，资源，项目管理，资金获取，正式分析。Zhang Wenli：撰写-审阅与编辑，验证，监督，资源，项目管理，资金获取。Zhu Yingying：验证，资源，项目管理，概念化。Sun Hong：方法学，调查，

未引用参考文献

Wan et al., 2024a.

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能看起来会影响本文中报告的工作。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2025YFC3409500）、国家自然科学基金（编号32302010）和江苏省自然科学基金（编号BK20251614）以及江南大学食品科学与工程省部共建国家重点实验室研究计划（编号SKLF-ZZA-202501）的资助。

Ke Juntao | Li Wan | Cao Yehong | Chen Maiqi | Gao Yunan | Sun Hong | Zhu Yingying | Zhang Wenli | Mu Wanmeng