13C代谢通量分析揭示大肠杆菌ΔmetA菌株在甲硫氨酸限制条件下的代谢重编程及氨基酸分泌

《Metabolic Engineering》：13C-Metabolic flux analysis uncovers rewiring in Escherichia coli ΔmetA metabolism and secretion of amino acids in response to methionine limitation

　　

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  大肠杆菌ΔmetA菌株在甲硫氨酸限制条件下分泌谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸和甘氨酸
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  为ΔmetA菌株的¹³C-MFA开发了更新后的代谢网络模型
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  甲硫氨酸限制诱导了核心代谢、氨基酸代谢和一碳代谢中的通量重排
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  我们的结果解释了ΔmetA菌株与其他营养缺陷型菌株共培养的表现

引言

营养缺陷型微生物已经进化出在必需营养物质（如氨基酸和维生素）稀缺的环境中生存甚至蓬勃发展的能力，而这些营养物质往往需要通过细胞间交叉喂养从其他微生物处获得（Johnson等人，2020；Ramoneda等人，2023；Starke等人，2023；Zengler和Zaramela，2018）。在必需营养物质饥饿条件下，细菌可以激活多条调控通路以重新调整代谢，从而提高生存几率（Cote等人，2016；Peterson等人，2005；Shimizu，2013）。一个广为人知的例子是严苛反应，它由氨基酸饥饿触发，并通过鸟苷四磷酸/五磷酸（ppGpp）介导（Bennett等人，2020；Ferullo和Lovett，2008；Traxler等人，2008）。这种反应调节基因表达并减缓生物合成过程以促进细胞维持。通过了解细胞在营养限制条件下如何调控和重新编程其代谢，我们可以更深入地理解微生物的适应策略以及它们对不同营养环境的进化响应。

在所有必需营养物质中，氨基酸在细胞代谢和生长中发挥着尤为关键的作用。氨基酸的耗竭会停止蛋白质合成并引发广泛的代谢变化（Brunschede和Bremer，1971；Reeh等人，1976；Traxler等人，2008）。甲硫氨酸尤为引人注目，因为它具有双重作用：1)它是蛋白质翻译的起始氨基酸；2)它是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的前体，SAM是参与多种生化过程的通用甲基供体。在大肠杆菌中，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶（MetA），即甲硫氨酸生物合成途径中的第一个酶，已知在各种应激条件下充当调控节点（Biran等人，2000；Mordukhova等人，2013；Mordukhova和Pan，2014）。例如，MetA具有高度温度敏感性，在高温下容易聚集，导致甲硫氨酸饥饿和生长受限，这可能增加细胞在应激条件下的存活率（Gur等人，2002；Schink等人，2022）。在一些研究中，发现添加过量甲硫氨酸可以缓解弱酸应激下的生长抑制（Mordukhova等人，2008）。这些发现表明，甲硫氨酸限制可以作为生长和存活的检查点，触发生成蛋白质、DNA和RNA减少以及代谢重组等全局性响应，以防止进一步损伤。

鉴于甲硫氨酸的调控重要性，在本研究中，我们旨在探索甲硫氨酸限制如何塑造大肠杆菌的生理和代谢。具体而言，我们使用了甲硫氨酸营养缺陷型大肠杆菌菌株ΔmetA作为模型系统。该ΔmetA菌株在两种不同条件下培养：1)甲硫氨酸过量条件，即在培养基中加入足够甲硫氨酸以允许不受限制的生长；2)甲硫氨酸限制条件，即将细胞外甲硫氨酸浓度维持在1 μM以下以诱导甲硫氨酸限制响应。为了量化对甲硫氨酸限制响应的代谢重排，我们使用平行标记实验结合¹³C代谢通量分析（¹³C-MFA）。通过这些调查，我们发现了核心代谢途径中的显著代谢通量变化，包括戊糖磷酸途径、TCA循环和回补反应中的变化；一碳代谢中通量的重排，包括甲基化循环中的通量；最后，我们检测到在甲硫氨酸限制条件下意外分泌氨基酸，其中最重要的是谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸和甘氨酸。最后，我们进行了ΔmetA菌株与十种不同营养缺陷型大肠杆菌菌株的共培养实验，并能够解释这些共培养的生长表现。综上所述，这些结果强调了营养限制对大肠杆菌生理和代谢的广泛影响。此外，本研究的结果提供了有价值的见解，可以帮助未来的微生物群落研究。最终，我们期望这将有助于更好地制定工程化稳定共培养和更复杂群落以应用于代谢工程的策略。

章节摘要

ΔmetA菌株在甲硫氨酸过量和甲硫氨酸限制条件下的生理特性

为了研究ΔmetA菌株的生理和代谢，使用[1,2-¹³C]葡萄糖和[1,6-¹³C]葡萄糖作为同位素示踪剂进行了平行标记实验。这些示踪剂此前已被确定为用于大肠杆菌细胞内代谢通量高分辨率量化的最佳选择（Crown等人，2016）。由于大肠杆菌ΔmetA是甲硫氨酸营养缺陷型，补充甲硫氨酸是细胞生长所必需的。我们旨在研究甲硫氨酸的可用性

讨论与结论

在本研究中，我们调查了甲硫氨酸可用性如何影响大肠杆菌的表型和代谢。我们使用了来自Keio基因敲除集合的甲硫氨酸营养缺陷型大肠杆菌ΔmetA菌株作为模型系统。该菌株缺乏高丝氨酸O-琥珀酰转移酶，即甲硫氨酸生物合成途径中的第一个酶，使其严格依赖外源补充的甲硫氨酸才能生长。为了鉴定代谢和生理变化，该菌株在两种

菌株和材料

所有营养缺陷型大肠杆菌菌株均来自Keio基因敲除集合（GE Healthcare Dharmacon），这些菌株通过在大肠杆菌K-12 BW25113中进行一步基因失活构建而成（Baba等人，2006）。化学品和M9最小培养基购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。所有培养基和储备液均通过过滤灭菌。¹³C示踪剂购自Cambridge Isotope Laboratories（马萨诸塞州特克斯伯里）：[1,2-¹³C]葡萄糖（99%），[1,6-¹³C]葡萄糖（99%），[U-¹³C]葡萄糖（99%），[U-

CRediT作者贡献声明

Maciek Antoniewicz：撰写——审阅与编辑，可视化，监督，项目管理，资助获取，概念化。Yijing Cai：撰写——初稿，可视化，验证，方法学，调查，形式化分析，数据整理，概念化

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国家科学基金会资助，项目编号1616332。

Yijing Cai|Maciek R. Antoniewicz