大肠杆菌中通过源自放线菌门的新型MVA途径实现高水平萜烯合成

《Metabolic Engineering》：High-level terpene production via a novel Actinomycetota-derived MVA pathway in E. coli

　　

通过放线菌门（Actinomycetota）大规模基因组挖掘揭示MVA途径的景观•从精英萜类生产菌株中合理筛选MVA供体•构建含MVA途径的工程化大肠杆菌BL21(DE3)，突破萜类前体瓶颈•工程化改造实现了长叶烯产量的突破，达到947.80 mg/L

1. 引言

萜类化合物是有价值的天然产物，在药物发现中具有巨大潜力，通常由植物、真菌和某些细菌生产（Cragg, 1998）。然而，其天然产量，尤其是细菌来源的产量，往往过低，难以实现高效纯化。为克服这一限制，代谢途径工程提供了一种可行的替代方案，通过在合适的宿主菌中异源生产萜类化合物（Manina等，2023）。所有萜类化合物均由通用的五碳前体——异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）生物合成（Boronat等，2015）。这些前体的高效供应对于实现高产量萜类化合物的生产至关重要。在自然界中，合成IPP和DMAPP的两条主要途径是：2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径，主要存在于原核生物中；以及甲羟戊酸（MVA）途径，广泛分布于原核和真核物种中（Helfrich等，2019）。由于这些生物合成途径的普遍存在，微生物可作为开发萜类化合物异源表达体系的可行宿主。

目前，微生物萜类化合物的生产主要利用大肠杆菌（*E. coli*）和酿酒酵母（*S. cerevisiae*）作为表达平台（Moser等，2019）。其中，大肠杆菌因其快速增殖和易于培养的特点而受到青睐（Bertels等，2021）。为增强大肠杆菌中萜类化合物的异源生产，一种有前景的策略是引入外源甲羟戊酸（MVA）途径，以增加萜类前体IPP和DMAPP的供应。具体而言，在大肠杆菌中，这些前体仅由MEP途径原生合成（Liu等，2014）。与内源MEP途径相比，异源MVA途径具有多个优势：将葡萄糖转化为IPP时比MEP途径更节能（Zhao等，2011），不受宿主内源调控机制的影响，并避免了毒性中间产物的积累（Rinaldi等，2022）。因此，将MVA途径引入大肠杆菌可克服仅依赖原生MEP途径的局限性，从而增强前体供应，促进萜类化合物产量的提升。

MVA途径通过一系列酶促反应将乙酰辅酶A转化为通用萜类前体IPP和DMAPP。该途径主要由六种关键酶催化：羟基甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）合酶（HMGS）、HMG-CoA还原酶（HMGR）、甲羟戊酸激酶（MVK）、磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MPD）和异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）（Peralta-Yahya等，2011）。由于大多数萜类化合物天然来源于植物和真菌，因此大量研究集中于在异源宿主中表达真核MVA途径，尤其是来自酿酒酵母的途径（Martin等，2003a）。另一种策略采用组合途径，将来自不同来源的酶组合使用，如大肠杆菌和酿酒酵母（Peralta-Yahya等，2011），或大肠杆菌、粪肠球菌和酿酒酵母（He等，2018）。然而，将真核来源的MVA途径转移到大肠杆菌中进行异源表达可能需要去除内含子，这可能损害RNA稳定性（Hamer等，1979）并降低整体表达水平（Mascarenhas等，1990）。相比之下，细菌来源的MVA途径在像大肠杆菌这样的原核宿主中可能表达效率更高。

在细菌中，放线菌门（Actinomycetota）以其拥有MVA途径而著称（Dairi等，2012）。例如，链霉菌属（*Streptomyces* sp.）CL190利用该途径生产萜类化合物naphterpin（Seto等，1996）。因此，本研究采用来源于放线菌门的MVA途径，该门已知拥有此途径（Lombard等，2011）。利用公共数据库中的大量基因组数据（Challis, 2008），我们采用基因组挖掘方法高效筛选出合适的放线菌菌株，从而制定了增强大肠杆菌中萜类前体生物合成的针对性策略。通过我们的计算机多层分析，从25,261株放线菌中筛选出马源克氏菌（*Crossiella equi*）DSM44580，并分析其萜类代谢组以确认其代谢能力。选取其MVA途径酶（图1）进行异源表达，构建了新的大肠杆菌MVA平台（ecMVA-1和ecMVA-2）。后续效率评估表明，该系统在IPP/DMAPP和FPP前体供应、萜类化合物生产成功率以及总产物产量方面，均显著优于混合MVA途径（He等，2018）。此外，当用于生产抗疟药青蒿素的前体长叶烯时，该平台达到了947.80 mg/L的产量。

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图1. 工作流程概览。（a）目标MVA途径筛选逻辑。通过蛋白BLAST从挖掘的放线菌基因组中筛选含有MVA途径相关蛋白的菌株。经评估后，选择含有完整MVA途径的菌株，并进一步鉴定和定量其萜类生物合成基因簇（BGCs）。选择萜类BGCs占总BGCs比例超过25%的菌株，并使用EFI-EST将其萜类BGCs构建序列相似性网络。目标菌株的筛选标准包括：拥有最多萜类BGCs、萜类BGCs占比高，以及在分子网络中萜类BGCs分布广泛——既包含与其他基因簇高度相似的BGCs，也包含大量离散且远缘的BGCs。（b）马源克氏菌DSM44580原生MVA基因簇的遗传组织结构。（c）双表达体系示意图。ecMVA-1质粒携带MVA途径基因，工程化改造的ecMVA-2质粒在HMGR下游插入了编码乙酰辅酶A乙酰转移酶（ACAT）的基因，并在IDI下游插入了法尼基焦磷酸（FPP）合酶基因以增强前体供应，两者均转化至BL21(DE3)中与pET-TS共表达。

2. 材料与方法

2.1 基本信息

本研究中使用的全部放线菌菌株均来自莱布尼茨德意志培养物保藏中心（DSMZ）。克隆工作使用大肠杆菌DH5α和TOP10菌株，大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主。化合物分析使用安捷伦7890A气相色谱仪联用5975C质谱选择器（GC-MS；Agilent，美国），以电子轰击电离（EI）模式运行。大规模发酵使用CytoLinX? GB 7L台式玻璃生物反应器，配备溶解氧传感器VISIFERM DO ECS 120 H2、pH传感器EASYFERM PLUS PHI VP120 PT100以及10M DC电缆VP8/开放式终端。

2.2 全基因组挖掘和生物信息学分析

从美国国家生物技术信息中心（NCBI）获取GenBank注释的RefSeq放线菌基因组（截至2024年7月5日）。使用antiSMASH v7.0.1（Blin等，2023）从这些基因组中鉴定编码次级代谢物的生物合成基因簇（BGCs）。利用EFI-Enzyme Similarity Tool（EFI-EST）（Oberg等，2023），以E值为1.0 × 10??、比对分数阈值为10的参数，使用每种同一性的315种萜类BGCs代表性核心酶构建序列相似性网络（SSN）（Zallot等，2019），并通过Cytoscape 3.9.1（Shannon等，2003）展示网络。参考MVA途径来源于链霉菌属CL190菌株，该菌株被认为是大肠杆菌中功能性MVA途径异源表达的首个真细菌来源（Takagi等，2000）。该MVA途径包含6种关键酶，包括HMGS、HMGR、MVK、PMK、MPD和IDI（Kaneda等，2001）。经BLAST比对（Johnson等，2008）参考酶后，本研究的目标菌株被选定，相关基因见附表S2.1和附表S2.2。MVA途径相关酶的基因簇比对使用Clinker（Gilchrist等，2021）进行分析，该软件使用BLOSUM62在蛋白水平自动比对翻译后的编码序列（CDS）。

2.3 萜类代谢组分析

对马源克氏菌DSM 44580的代谢物进行萜类代谢组分析。野生型菌株在ISP2培养基（10 g/L麦芽浸膏、4 g/L酵母浸膏和4 g/L葡萄糖）中培养，其代谢物通过UPLC-ESI-MS/MS进行分离和鉴定（Pang等，2022）。通过与数据库比对确定该菌株产生的萜类相关代谢物的数量和分类。详细实验步骤见补充材料（补充信息Part S1）。

2.4 通用分子生物学方法

本研究中使用的全部细菌菌株和载体见附表S2.1。寡核苷酸引物和基因构建体，包括马源克氏菌DSM 44580 MVA途径基因的密码子优化版本，由擎科生物合成（附表S2.2）。野生型放线菌的基因组DNA（gDNA）使用天根基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN Biotech）提取。聚合酶链反应（PCR）使用2 × Phanta Max Master Mix（Vazyme Biotech）或Q5高保真DNA聚合酶（New England Biolabs）进行。PCR产物使用Macherey-Nagel NucleoSpin凝胶和PCR纯化试剂盒（TIANGEN Biotech）从琼脂糖凝胶中纯化。所有限制性内切酶购自New England Biolabs。DNA片段和质粒浓度使用Biochrom BioDrop μLite+测定。质粒组装使用Gibson组装法（New England Biolabs），质粒DNA使用天根mini质粒提取试剂盒（TIANGEN Biotech）提取。

2.5 MVA途径表达质粒构建

使用双启动子表达质粒pCDFDuet-1（Lim等，2015）作为表达质粒，表达马源克氏菌DSM 44580密码子优化的MVA途径基因（图1c）（命名为ecMVA）。具体而言，HMGS和HMGR基因使用BamH I和EcoR I限制性内切酶插入第一个多克隆位点（MCS）。其余四个基因MVK、PMK、MPD和IDI使用Nde I和Xho I限制性内切酶克隆至第二个MCS（图1c）。所得构建体命名为ecMVA-1并转化至大肠杆菌DH5α。转化子在LB琼脂平板上筛选，并在补充50 μg/mL链霉素（Sigma-Aldrich）的LB肉汤（OXOID）中以220 rpm振荡培养。

2.6 ecMVA-1和目标萜类合酶在BL21(DE3)中的异源表达

使用附表S2.2中列出的引物扩增来自不同放线菌的选择性倍半萜合酶基因，并克隆至pET-28a(+)载体中。所得构建体命名为pET-TS（图1c），转化至大肠杆菌Top10（Sambrook等，1989）。转化子在含有50 μg/mL卡那霉素（Sigma-Aldrich）的LB肉汤和琼脂平板上筛选培养。随后，将不同的pET-TS质粒引入含有ecMVA-1的BL21(DE3)中，同时将它们转化至pMVA（He等，2018）系统进行对比。克隆筛选后，将阳性转化菌接种至10 mL TB培养基中（含50 μg/mL链霉素和50 μg/mL卡那霉素），在20°C、200 rpm下培养，当OD???达到约0.4时添加0.5 mM IPTG进行诱导。TB培养基组成为：12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母浸膏、4 mL/L甘油、0.2%葡萄糖、0.017 M磷酸氢二钾和0.072 M磷酸氢二钾，所有组分购自Sigma-Aldrich。

培养4天后，用10 mL乙酸乙酯对培养液进行四次提取，以15,000 rpm离心10分钟。合并有机相，用无水硫酸镁（Sigma-Aldrich）干燥，并通过GC-MS分析。通过将质谱碎裂模式与NIST数据库进行匹配来初步鉴定化合物结构，仅将匹配因子大于90%的结果视为推定鉴定。

2.7 ecMVA-1和pMVA在大肠杆菌中代谢中间产物的相对定量分析

为比较两种MVA途径变体的代谢效率，将携带ecMVA-1或pMVA（两者均与编码长叶烯-4,11-二烯合酶的pAnn质粒共转化）的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在上述相同条件下培养于TB培养基中。每种菌株制备六个生物学重复。培养4天后，离心收获细胞，弃去上清液。细胞沉淀进行代谢物提取，提取物通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析。通过与数据库比对鉴定代谢物（Shang等，2022），并进行相对定量以比较两个系统中关键中间产物的丰度。代谢物提取、LC-MS参数和数据库比对的详细步骤见补充信息Part S1。

2.8 BL21(DE3)中ecMVA和长叶烯-4,11-二烯合酶的表达

编码长叶烯-4,11-二烯合酶（ACL15394.1）（Wang等，2013）的基因由擎科生物合成并克隆至pet28a(+)质粒中，产生命名为pAnn的构建体（图1c）。

此外，考虑到异莰烯二烯合酶是一种倍半萜合酶，我们构建了一个伴生质粒，共同表达法尼基焦磷酸（FPP）合酶（WP_113844890.1）合酶和乙酰辅酶A乙酰转移酶（ACAT）（WP_004095374.1），以增强倍半萜前体的供应。该质粒被命名为ecMVA-2。将pAnn分别与ecMVA-1或ecMVA-2（图1c–表S2.3）转入大肠杆菌BL21（DE3）中，然后在含有50 μg/mL链霉素和50 μg/mL卡那霉素的LB培养基和琼脂平板上培养。该质粒的示意图如图1c所示。2.9. 生物反应器大规模发酵效率检测在大肠杆菌BL21（DE3）中含有ecMVA-1和pAnn或ecMVA-2和pAnn的情况下，利用生物反应器对大规模发酵效率进行了评估。所有扩大规模发酵均在7升全自动搅拌罐生物反应器（工作体积：5升）中进行，该反应器配备有温度、pH值、溶解氧（DO）、搅拌和泡沫控制系统。策略I的条件如下：将种子培养物接种至100毫升LB培养基中，接种量为1%（v/v）进行种子活化，随后在37°C、180 rpm的旋转摇床上培养，直至600纳米处的吸光度（OD600）达到0.8。然后，将5升TB培养基在115°C湿热灭菌20分钟。将活化后的种子培养物以2%（v/v）的接种量接种到灭菌后的TB培养基中。当OD600达到0.4时，使用0.5毫摩尔异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达。随后将培养物转移至7升发酵罐，维持在20°C、180 rpm。为防止因营养耗竭导致的细菌死亡并确保诱导阶段有充足的底物供应，一旦检测到pH值和溶解氧（DO）均出现上升，即以7克/升/小时的速度开始流加补料。在诱导后的多个时间点进行时间序列采样：早期阶段（21和24小时）、中期阶段（40和48小时）和后期阶段（72和89小时），以监测细胞生长、底物消耗和代谢物分布。策略II旨在优化生物反应器工艺，将2%的种子培养物直接接种到发酵罐中。培养物在37°C下搅拌培养，直至OD600达到10-12，用0.5毫摩尔IPTG诱导，并在20°C、900 rpm下培养。间歇补充培养基以在72小时发酵期间将残余葡萄糖浓度维持在10-20克/升。在此期间，通过调节酸碱平衡将生物反应器中的pH值维持在7.0±0.2。在诱导后23、27、34、57、69和72小时采集培养物样品以供后续分析。在每个时间点，采集10毫升样品用于后续的的气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析。2.10. 化合物的GC-MS分析粗提物使用DB5毛细管柱（30米，0.25毫米内径，0.25微米膜厚，安捷伦）进行分离，温度程序为50–300°C，300°C–310°C，温度梯度分别为7°C/分钟和20°C/分钟，并在310°C保持2分钟。进样口温度设定为300°C，分流比为10:1，进样量为1微升。使用氦气作为载气，恒流速为1毫升/分钟（压力：7.6522 psi）。质谱检测使用250°C的离子源温度。在电子轰击（EI）模式下以70电子伏特采集光谱，扫描质量范围从m/z 50至m/z 450。2.11. 标准曲线绘制、定量分析和计算异莰烯二烯合酶催化形成异莰烯二烯。使用乙酸乙酯配制的浓度为1、5、10、25、50、75和100微克/毫升的标准溶液建立了异莰烯二烯的校准曲线。这些标准品通过GC-MS进行分析。结果表明分析物浓度与检测器响应之间存在强相关性（图S2.1）。绘制峰面积与分析物浓度的外部校准曲线表现出优异的线性，决定系数（R2）为0.9990。待测样品用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯提取的有机相浓缩至最终体积10毫升。在浓缩之前，向样品溶液中加入5微克/毫升的橙花叔醇作为内标。然后取1微升浓缩液注入GC-MS进行分析。3. 结果与讨论3.1. 全基因组挖掘揭示放线菌门中的MVA途径为了系统地探索MVA途径在放线菌门中的分布和保守性，本研究开展了一项全基因组挖掘工作。这一广泛的同源性搜索在25,261个放线菌门基因组中识别出920株菌株编码MVA途径中一个或多个关键酶的同源物（图1a），如表S2.4中全面编目所示。按所含酶数量分布的菌株分布如下：相当大一部分（36.52%）菌株仅含有单一酶，而13.70%和9.78%的菌株分别含有两种和三种酶。较小但显著的群体保持着更为重要的途径片段，其中4.89%和10.00%分别编码四种和五种酶。关键的是，相当比例的菌株（25.11%）被发现编码完整的六种MVA途径酶（图2a）。由于细菌的水平基因转移，某些细菌酶可能源自环境或其他生物体（Hotopp，2011）。MVA途径中的这六种酶除了作为MVA途径的一部分外，还具有其他功能。例如，HMGS和HMGR参与哺乳动物细胞中胆固醇的生物合成（Salam等，1989）。PMK不仅参与类异戊二烯合成，还在甾醇生物合成中发挥重要作用（Herdendorf等，2006）。因此，与仅含有部分酶的菌株（可能仅能产生某些中间体）相比，拥有全部MVA途径酶的菌株具有合成萜烯前体的能力。基于上述统计结果，我们进一步从这25.11%的菌株（231株，表S2.5）中选择了MVA途径进行异源表达。下载：下载高分辨率图片（589KB）下载：下载全尺寸图片图2. 放线菌门中MVA途径和萜烯类化合物的基因组分析。（a）根据鉴定的MVA途径蛋白数量分布的放线菌门菌株。饼图显示含有1至6种完整MVA途径蛋白的菌株比例。（b）含有最高比例萜烯类生物合成基因簇（BGCs）的前7株菌株的MVA途径基因簇比对Clinker可视化。基因簇以百分比同一性显示。（c）这些菌株的BGC数量可视化。红色代表萜烯类BGC，灰色代表其他类型的BGC。（d）使用Cytoscape 3.9.1建立的萜烯类BGC核心酶序列相似性网络。这些萜烯合酶属于萜烯类BGC比例超过25%的菌株。红色圆圈代表来自目标菌株Crossiella equi DSM44580的萜烯合酶。灰色代表来自其他菌株的合酶。（关于图例中颜色引用的解释，读者请参考本文的网络版本。）3.2. 目标MVA途径的选择由生物合成基因簇（BGCs）编码的次级代谢物对于微生物在自然环境中的竞争和生存至关重要（Monteiro等，2025）。然而，次级代谢物的合成经常受限于前体供应，使其成为生产力的关键因素。因此，我们假设在遗传上，更大的BGC库意味着更强大的前体供给系统，因此基因组中萜烯类BGC的数量和比例可以作为宿主对于萜烯类化合物通量固有能力的指示，也是我们基因组挖掘流程中的优先参数。结果表明，在231株含有完整MVA途径的放线菌门菌株中，33株菌株的萜烯类BGC占比超过25%（表S2.5）。它们的MVA途径相关酶基因簇比对显示高度的序列相似性和强的同源性保守（图2b，图S2.2），而它们与植物和真菌来源的相似性则显著较低（Zhang等，2021；Wang等，2023；Navia-Giné等，2009；Yang等，2013）（图S2.3）。其中，Crossiella equi DSM 44580共有16个萜烯类BGC，在33株菌株中拥有最高的萜烯类BGC数量。其萜烯类BGC占总BGC数的31.37%，在33株菌株中排名第4。（图2c）。此外，其萜烯类BGC的推定功能比其他菌株更为多样。例如，其TSs可被归类为β-胡萝卜素萜烯合酶、土臭素合酶、4-表-环木曼醇合酶、异非洲烯合酶、角鲨烯/植物甙素合酶等（表S2.6）。通过对含有超过25%萜烯类BGC比例的菌株的萜烯类BGC核心酶进行序列相似性网络分析（图2d），Crossiella equi DSM 44580的萜烯类BGC表现出广泛性和独特性。因此，选择了来自Crossiella equi DSM 44580的途径（图1b）作为后续在大肠杆菌中异源表达的MVA途径（图S2.4）。为进一步在代谢组学水平上验证C. equi MVA途径的选择，我们对标准条件下培养的C. equi DSM 44580野生型菌株进行了萜烯类图谱分析。从合并的胞外（上清液）和胞内（菌体沉淀）组分中共推测鉴定出309种萜烯类相关代谢物（图S2.5）。两个组分之间代谢物分布的比较分析显示，21种代谢物在上清液中显著富集，207种优先积累在菌体沉淀中，81种在两个组分之间无显著差异（图S2.6）。这些已鉴定的萜烯类化合物涵盖了广泛的结构类别，包括新倍半萜类、倍半萜类和三萜类（表S2.7），表明该菌株具有强大且多功能的萜烯类生物合成能力。鉴于在C. equi中检测到的萜烯类代谢物的多样性和丰富性，推测其内源MVA途径具有强大的前体供应能力，支持将其选为在大肠杆菌中异源表达的候选途径。3.3. 建立ecMVA-1和ecMVA-2系统放线菌门基因组具有高GC含量，与大肠杆菌的密码子差异可能影响重组蛋白的表达水平（Menzella，2011）。为了在大肠杆菌BL21（DE3）中实现MVA途径的高效表达，将Crossiella equi DSM 44580的MVA途径酶（见补充信息）的密码子优化序列插入大肠杆菌表达质粒pCDFDuet-1中。将质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）后，将该转化体作为新的表达系统命名为ecMVA-1。为进一步优化新系统在萜烯类表达方面的效率，使用乙酰辅酶A作为HMG-CoA的前体（Wang等，2019）以提高其产量，这可以进一步影响MVA途径。除增加C5前体单位IPP和DMAPP外，通过提供更长的线型异戊二烯链如香叶基焦磷酸（GPP）、FPP和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP），所有高代萜烯类产物的产量也可增加（Song等，2023）。鉴于本研究聚焦于倍半萜TS表达，将ACAT和FPP合酶添加到ecMVA-1质粒中，该质粒被命名为ecMVA-2，作为另一个表达系统（图1c）。3.4. ecMVA系统表达效率的验证将ecMVA系统与现有的MVA途径进行比较可以更好地说明其表达效率。在此，我们选择含有pMVA的大肠杆菌BL21（DE3）作为对照系统。与ecMVA-1中全部来自放线菌门的酶不同，pMVA系统中的酶是来源于粪肠球菌、酿酒酵母和大肠杆菌的杂交酶（Mascarenhas等，1990）。为进一步验证ecMVA-1在促进萜烯类生物合成方面的有效性，我们选择了来自不同放线菌门菌株的七种不同的TS基因。构建的pET-TS质粒（见表S2.1和表S2.2）分别使用pMVA和ecMVA-1系统进行异源表达。用GC-MS分析在相同浓度下提取的代谢物，如图3所示。值得注意的是，在pMVA系统下仅有四种TS（DiaA、RenA、NanA、LevA）产生了可检测的产物，但ecMVA-1表达的所有TS均成功产生了对应的化合物（表S2.8），且产量水平显著更高。为探究导致这种增强表现的代谢基础，我们对两种系统进行了MVA途径中间体的非靶向LC-MS分析。结果显示，ecMVA-1中IPP和FPP的水平分别比pMVA高1.21倍和1.54倍，表明ecMVA-1途径具有更高效的前体供应（表S2.9）。所表达萜烯类化合物的详细结构和定量数据见补充信息。

通过比较 pMVA 和 ecMVA-1 产物的峰面积积分值，可以直观地看出 ecMVA 系统的优越性能（图 4）。与 pMVA 系统共表达相比，ecMVA-1 系统使 pET-DiaA、pET-RenA、pET-NanA 和 pET-LevA 的表达水平分别提高了约 9.0、3.6、2.7 和 2.6 倍。这种在多种 TS 基因中成功率和产量水平的显著提高，证实了 ecMVA 是萜类生物合成的一个强大且通用的平台。
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图 3. 异源萜类生产评估 pMVA（蓝色）和 ecMVA-1（红色）系统。七种不同萜类合成酶（TS）基因在大肠杆菌中表达的萜类产量气相色谱 - 质谱（GC-MS）分析。对于每种 TS，使用 pMVA 系统（蓝色）达到的产量水平与优化后的 ecMVA-1 系统（红色）进行比较，展示了 ecMVA-1 增强的前体供应能力。萜类结构基于 GC-MS 分析和数据库匹配进行推测鉴定，仅保留相似度得分高于 90% 的结构。（对于图例中颜色的解释，读者请参考本文的网络版本。）
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图 4. 不同 TS 在 pMVA 和 ecMVA-1 系统中表达的积分值。蓝色柱状图代表使用 pMVA 系统表达的不同 TS。红色柱状图代表使用 ecMVA-1 系统表达的不同 TS。（对于图例中颜色的解释，读者请参考本文的网络版本。）

3.5. 使用 ecMVA-1 和 ecMVA-2 系统定量分析青蒿二烯合成酶的表达效率
鉴于 TS 的成功高效表达，我们随后评估了青蒿二烯（青蒿素的关键前体）的生产效率，以评估未来工业应用的可行性（Westfall et al., 2012）。将质粒 pAnn 引入四种不同的大肠杆菌 BL21(DE3) 菌株中：野生型菌株，以及分别含有 pMVA、ecMVA-1 和 ecMVA-2 的菌株。这些菌株提取物 GC-MS 分析结果如图 5a 所示。青蒿二烯的保留时间约为 17.6 分钟（图 5a）。峰面积的积分结果（图 5b）显示，前两个表达系统并未在青蒿二烯产量上产生显著改善，而 ecMVA-1 和 ecMVA-2 系统则显著提高了该化合物的产量。根据已建立的青蒿二烯校准曲线（图 S2.1），ecMVA-1 和 ecMVA-2 系统中青蒿二烯的产量被量化，最终浓度分别达到 60.03 mg/L 和 293.36 mg/L。
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图 5. 工程大肠杆菌菌株中青蒿二烯产量的定量分析。（a）比较不同表达系统中青蒿二烯生产的代表性 GC-MS 色谱图：对照菌株（黑色），携带 pMVA 系统的菌株（蓝色），带有 ecMVA-1 系统的菌株（绿色）和带有优化 ecMVA-2 系统的菌株（红色）。指示了青蒿二烯对应的峰。（b）不同表达系统青蒿二烯产量 GC-MS 分析的积分。（对于图例中颜色的解释，读者请参考本文的网络版本。）

3.6. 不同喂养策略下的补料分批发酵性能
为了研究喂养策略对目标产品滴度的影响，在 7-L 生物反应器中评估了两种放大发酵方案。在初始策略（策略 I）中，在 TB 培养基中当 OD600 较低（0.4）时触发诱导，恒定喂速为 7 g/L/h，且不控制 pH 值。在此条件下，最终产品滴度 ecMVA-1 达到 138.34 mg/L，ecMVA-2 达到 300.38 mg/L，相较于摇瓶基线（ecMVA-1 为 138.34 mg/L）有所提升。相比之下，当喂养策略修改为葡萄糖维持制度（策略 II）时，其中诱导延迟至高细胞密度（OD600 = 10-12）进行，残留葡萄糖被仔细维持在 10-20 g/L，并将 pH 控制在 7.0 ± 0.2，产品滴度得到了显著提高。ecMVA-1 菌株达到 398.10 mg/L，与策略 I 中的 ecMVA-1 相比提高了 2.88 倍，而 ecMVA-2 在第 72 小时达到了 947.80 mg/L 的最大滴度，与策略 I 相比提高了 3.15 倍（图 S2.7）。
这些结果表明，高密度诱导结合受控的葡萄糖喂养策略有效地提高了产品积累。产品滴度的显著增加主要是由高密度诱导（OD600 = 10-12）驱动的，这确保了异源表达前有足够的生物量，从而最大化了细胞内前体用于产品生物合成的可用性（Lokireddy et al., 2025）。此外，维持残留葡萄糖浓度在 10 到 20 g/L 之间的补料分批发酵策略防止了碳源耗竭，同时确保了整个长期发酵过程中代谢活动的持续（Salehmin et al., 2013）；相比之下，恒速喂养在各个生长阶段存在营养限制或溢流代谢的风险。在整个过程中将 pH 值稳定维持在 7.0 最小化了葡萄糖代谢通常相关的酸应激，从而在生产阶段保留了最佳的细胞生理状态和酶活性（Zakrzewski et al., 2022）。
值得注意的是，本研究中达到的 947.80 mg/L 产品滴度与几项先前报道的研究相比表现优异。在早期努力中，Martin 等人（2003b）报道使用工程化的甲羟戊酸途径青蒿二烯浓度仅为 24.00 mg/L。Ma 等人（2011）报道在大肠杆菌中补料分批发酵 48 小时后达到 700.00 mg/L。相比之下，通过广泛的菌株工程和发酵优化，大肠杆菌中报道的最高青蒿二烯滴度达到了更高水平。Shukal 等人通过系统优化营养缺陷型大肠杆菌菌株报道了 30.00 g/L 的产量（Shukal et al., 2019）。这些比较突出了我们 ecMVA 系统的竞争力，特别是考虑到我们的工艺是在没有进行广泛菌株工程的情况下进行的，这表明进一步的改进是容易实现的。

4. 结论
本研究结合了生物信息学驱动的靶向挖掘、合成生物学指导的底盘细胞理性设计以及系统平台性能验证，形成了一个强有力的正向循环。本研究通过全球基因组挖掘识别了 25,261 株放线菌门菌株，其中 231 株拥有完整的 MVA 途径，突显了该门内萜类前体生物合成的巨大潜力。基于萜类生物合成基因簇（BGCs）的丰富度和基因组富集情况，马叉囊菌 DSM 44580（Crossiella equi DSM 44580）被选为最佳的 MVA 途径供体。该途径在大肠杆菌 BL21(DE3) 中的异源表达产生了一种能够共利用异源 MVA 和原生 MEP 途径的新型底盘细胞。通过表达多种萜类合成酶（TSs）成功验证了该工程化平台的效率，所有酶均显示出显著提高的萜类产量。
定量分析表明，在工程菌株中异源表达青蒿二烯合成酶（Amorpha-4,11-diene Synthase），共表达 FPP 和 ACAT，将青蒿二烯滴度从 60.03 mg/L 显著增加到 293.36 mg/L。在生物反应器培养后，滴度进一步增加到 ecMVA-1 为 398.10 mg/L（6.6 倍）和 ecMVA-2 为 947.80 mg/L（3.2 倍），突显了受控发酵条件在释放这些菌株代谢潜力中的关键作用。然而，ecMVA-2 产量回报递减也反映了可能限制进一步产量改进效率的代谢负担。尽管生物反应器培养可以有效地缓解环境限制，但产量提高的程度最终取决于工程化途径的功能平衡和能力。可能通过精细调节基因表达和宿主工程等策略实现更高的生产效率。

CRediT 作者贡献声明
Wenchao Liu: 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，软件，资源，方法学，调查，形式分析，数据管理。Xueying Tian: 撰写 – 审阅与编辑，可视化，软件，数据管理。Wai Chuen Wong: 数据管理，软件，验证，可视化，撰写 – 审阅与编辑。Zhihong Guo: 撰写 – 审阅与编辑，监督。Xin Huang: 数据管理，撰写 – 审阅与编辑。Jian-Wei Tang: 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，监督，方法学，形式分析，概念化，资金获取。Pei-Yuan Qian: 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，监督，资源，项目管理，资金获取，概念化。

资金
这项工作得到了南方海洋科学与工程广东省实验室（广州）（2021HJ01, SMSEGL24SC01）、香港特别行政区政府（16100425, T11/104/22R, STH2/P-604/25R）、香港科技大学潘宗光气候适应与可持续中心（CCRS25SC01）以及中国国家自然科学基金（编号 82003637）的资助。

Wenchao Liu|Xueying Tian|Wai Chuen Wong|Zhihong Guo|Xin Huang|Jian-Wei Tang|Pei-Yuan Qian