通过酶的广适性和代谢工程，解锁微生物对氨基取代的4-羟基香豆素衍生物的利用能力

《Metabolic Engineering》：Unlocking microbial access to amino-substituted 4-hydroxycoumarin derivatives via enzymatic promiscuity and metabolic engineering

　　•从取代的水杨酸生物合成多种4-羟基香豆素衍生物。•展示了5-氨基水杨酸的生物合成过程，这是一种获得FDA批准的药物。•在P. putida中实现了5-氨基水杨酸和6-氨基-4-羟基香豆素的首次从头合成。

1. 引言
香豆素是一种天然存在的苯并吡酮化合物，最早于1820年从tonka豆（Dipteryx odorata）中分离出来，此后在诸如芸香科、伞形科和豆科等超过150种植物中被发现（Sharifi-Rad等人，2021年；Vogel，1820年）。由于其融合的苯环和α-吡酮环结构，香豆素及其衍生物具有多种生理和生物特性，这些特性在过去两个多世纪中一直受到科学界的关注（Coumarin and its derivatives，2021年）。香豆素骨架的共轭π电子系统赋予了其显著的光物理性质，包括紫外线吸收和荧光，使其在光学和传感应用中备受关注（Cocco等人，2021年；Kaneko和Wang，2024年）。除了物理特性外，香豆素及其结构类似物还表现出广泛的药理活性——抗凝血、抗炎、抗菌和抗癌作用——这主要归功于香豆素骨架的多功能性，它可以在多个位置进行化学修饰（Annunziata等人，2020年；Balewski等人，2021年）。可以在C-3、C-6、C-7和C-8位置引入取代基，从而合成出具有定制特性的数千种衍生物，适用于药物化学和材料科学（Al-Warhi等人，2020年；Balewski等人，2021年；Samanth和Bhat，2024年；Tang等人，2024年）。据估计，2026年全球香豆素市场的规模为2.19亿美元，并预计到2035年将增长至3.7亿美元，应用领域包括药物制剂（占消费量的41%）、香料和化妆品（占32%）以及电镀和光学增亮剂等工业用途（Coumarin Market Size，Report，2025年，日期不详）。在香豆素的各种亚类中，4-羟基香豆素具有特别重要的药用价值，例如华法林，这是一种第一代抗凝血剂，在美国仍是120种最常用的药物之一，每年有超过500万份处方（Lin等人，2013a；Shen等人，2017年）。工业上香豆素的生产主要依赖于植物提取或化学合成。然而，植物提取受产量低、生长周期长和季节性变化的影响（Elmusa和Elmusa，2024年），而现有的化学合成方法通常需要苛刻的条件、有毒试剂以及多个步骤，并且区域选择性有限（Citarella等人，2024年；Vargas-Soto等人，2017年）。这些限制促使人们探索微生物生物合成作为一种可持续的替代方法。最近的研究通过异源表达来自铜绿假单胞菌的水杨酸-CoA连接酶和III型聚酮合成酶PqsD，在大肠杆菌中实现了多种香豆素衍生物的生物合成（Gan等人，2025年；Lin等人，2013a，2013b；Shen等人，2017年）。

在这项研究中，我们调查了PqsD与一种多用途的6-甲基水杨酸（6MSA）CoA连接酶MdpB2结合使用的底物范围，以将取代的水杨酸转化为相应的4-羟基香豆素衍生物。我们发现MdpB2-PqsD级联反应能够接受带有氨基、甲基和羟基的C4和C5取代的水杨酸，特别偏好C5位置的甲基和氨基取代底物。作为在这个扩展产品空间内构建从头合成路径的概念验证，我们选择了6-氨基-4-羟基香豆素（6A4HC），这是一种具有该亚类特征性4-羟基药效团和氨基取代基的衍生物，后者为进一步衍生提供了灵活性（Ghouse等人，2023年；Jung和Park，2009年；Kasperkiewicz等人，2020年）。为了生物合成这一目标，我们开发了一条从头合成其前体5-氨基水杨酸（5ASA）的路径，5ASA本身是一种获得FDA批准的抗炎药物（Segars和Gales，1992年），并将其与MdpB2-PqsD模块结合，实现了5ASA和6A4HC的微生物从头生产。这些结果凸显了微生物工程作为一种可持续策略的潜力，可用于生产结构多样且药理相关的4-羟基香豆素衍生物。

2. 材料与方法
2.1. DNA克隆
使用NEBuilder HiFi组装大师混合物（New England Biolabs）通过Gibson组装法构建质粒。有关所得质粒的详细信息见补充表S1和S2。Integrated DNA Technologies提供了本研究中使用的所有引物。PKS基因首先使用BaseBuddy进行了密码子优化（Schmidt等人，2023年），然后由Genscript合成。DNA扩增使用PrimeStar GXL大师混合物（Takara Bio），而Zymo Research试剂盒用于凝胶提取和质粒分离。
2.2. 菌株和培养基
橡树岭国家实验室的Guss实验室提供了Pseudomonas putida菌株AG5577。对于所有质粒扩增和分子克隆程序，我们使用了从New England Biolabs获得的5-alpha Iq E. coli菌株。本研究中使用的所有菌株的详细信息见补充表S3。质粒和菌株开发的培养以及发酵的种子培养都在LB培养基中进行（由10 g/L NaCl、10 g/L色氨酸和5 g/L酵母提取物组成）。在生产测试中，使用了M9YE培养基（M9最少培养基，含5 g/L酵母提取物和20 g/L葡萄糖）。
2.3. 菌株构建
菌株开发采用了SAGE技术进行基因整合（Elmore等人，2023年）。为了进行基因删除，使用了pk18sacB载体系统（Lee等人，2025年）。为了创建帧内删除，选择了1500-bp的同源重组序列用于上游和下游侧翼区域。由于P. putida中存在多个染色体拷贝，通过负性和阳性PCR筛查严格验证了目标基因的消除，以确保遗传背景的清洁。
2.4. 生产测试
工程化的P. putida菌株在添加了5 g/L酵母提取物和葡萄糖的M9最少培养基中培养。对于底物添加实验，培养基中添加了20 g/L葡萄糖。对于从头生产实验和代谢工程，培养基中添加了40 g/L葡萄糖。生产在24孔板中的2 mL培养物中进行，培养条件为30°C和200 rpm，培养时间为96小时。样品通过1:1的比例与甲醇混合（50%甲醇）后，使用Cytiva购买的AcroPrep? Advance 96孔过滤板进行过滤。然后对滤液进行液相色谱-质谱（LCMS）分析。
2.5. 产物分析
LCMS使用反相C18柱（4.6 × 150 mm，3.5 μm Agilent）。色谱方法采用甲醇-水梯度（含0.1%甲酸），流速为0.5 mL/min：初始5%甲醇（0-1分钟），线性增加到50%（1-4分钟），进一步增加到95%（4-8分钟），保持在95%（8-10分钟），然后回到5%（10-16分钟），最后平衡（16-18分钟）。定量基于从真实或商业可用标准品制备的校准曲线。
2.6. 4,6-二羟基香豆素和4,7-二羟基香豆素的化学合成
所有试剂均从Sigma-Aldrich购买并按原样使用。反应在氮气气氛下进行，使用经过火焰干燥的玻璃器皿并配有磁力搅拌器。烧瓶接口用橡胶塞密封。1H NMR和H去耦13C NMR谱在Bruker NEO-500 500 MHz谱仪上记录。表中的谱线以ppm表示，溶剂作为内标（H-NMR：CD3OD在3.21 ppm，含有痕量HOD在4.77 ppm；C-NMR：CD3OD在49.0 ppm）。数据以s = 单峰，d = 双峰，t = 三峰，q = 四峰，sx = 六峰，sp = 七峰，m = 多峰，b = 宽峰表示；耦合常数以Hz表示；积分也是如此。
香豆素的一般合成步骤如下：将二羟基苯（20 mmol）和马来酸（6.26 g，60 mmol）悬浮在MTBE（20 mL）中，并加热至50°C。然后通过注射器逐步加入BF3-Et2O（10 mL），整个过程持续10分钟，随后温度升高至80°C。混合物回流24小时。将热反应混合物直接倒入300 mL冰水中。沉淀物过滤并用MTBE（2 × 10 mL）洗涤，得到固体产物。
2.6.1. 4,7-二羟基香豆素
按照使用间苯二酚（2.20 g，20 mmol）的一般步骤，得到橙色固体产物（0.84 g，产率24%）。将505 mg该物质在热水（约50 mL）中重结晶，得到橙色针状晶体（407 mg，产率80%）。1H NMR（500 MHz，MeOD）δ 7.73（d，J = 8.7 Hz，1H），6.79（dd，J = 8.7，2.3 Hz，1H），6.69（d，J = 2.3 Hz，1H）。13C NMR（126 MHz，MeOD）δ 167.7，165.6，162.3，155.8，124.5，112.7，108.0，101.7。由于快速互变异构和质子交换，α-CH质子信号不存在。
2.6.2. 4,6-二羟基香豆素
按照使用对苯二酚（2.20 g，20 mmol）的一般步骤，得到淡粉色固体产物（0.76 g，产率21%）。1H NMR（500 MHz，MeOD）δ 7.23（d，J = 2.9 Hz，1H），7.19（d，J = 8.9 Hz，1H），7.08（dd，J = 8.9，2.9 Hz，1H）。13C NMR（126 MHz，MeOD）δ 166.9，165.2，153.9，147.3，120.7，117.2，116.4，107.2。由于快速互变异构和质子交换，α-CH质子信号不存在。

3. 结果
3.1. MdpB2-PqsD级联反应的底物范围
先前的研究表明，来自铜绿假单胞菌的PqsD天然可以接受未取代的水杨酰-CoA（Lin等人，2013a），但其对取代类似物的耐受性尚未得到充分研究。Gan等人报告说PqsD还可以接受2,5-二羟基苯甲酸（Gan等人，2025）。然而，我们怀疑这种底物限制可能是由于SdgA的底物范围有限，后者是一种已知能特异性将水杨酸激活为其CoA硫酯的CoA连接酶。为了解决这一假设，我们从Maduropeptin生物合成簇中选择了一种替代的CoA连接酶MdpB2（Van Lanen等人，2007）。已知MdpB2可以催化6-甲基水杨酸（水杨酸的取代类似物）的CoA活化，这表明其可能比SdgA具有更广泛的底物灵活性。将SdgA-PqsD和MdpB2-PqsD途径分别整合到P. putida AG5577中，创建了PP-SdgA-PqsD和PP-MdpB2-PqsD菌株。出乎意料的是，表达SdgA-PqsD途径导致P. putida生长严重缺陷，因此后续研究仅关注MdpB2-PqsD途径。
接下来，我们研究了MdpB2-PqsD途径的底物范围。提供了一组含有-C3、C4、C5或C6位置的-NH2、-NO2、-CH3或-OH取代基的水杨酸衍生物（图1a）。LCMS分析显示，-NH2、-CH3和-OH取代基在C4（对位）或C5（间位）位置成功结合，生成了相应的香豆素衍生物（图1）。相比之下，C3/C6异构体或-NO2/-OMe取代的底物未检测到产物。对于甲基和氨基底物，P. putida中的级联反应明显偏好C5（间位）底物，表现为6-取代香豆素（来自5-取代水杨酸）的产率显著高于7-取代香豆素（来自4-取代水杨酸）（图1d和e）。然而，这种位置偏好在羟基取代底物中并未观察到，因为5-羟基水杨酸和4-羟基水杨酸产生的4,6-二羟基香豆素（4,6DHC）和4,7-二羟基香豆素（4,7DHC）的产率相当（图1d和e）。这些发现大大扩展了香豆素生产的生物合成能力，特别是对于通常表现出独特生物活性的-NH2和-OH取代基。

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图1. MdpB2-PqsD级联反应用于合成取代香豆素的底物范围。(a) MdpB2-PqsD途径示意图及测试的水杨酸衍生物。接受的底物和产生的产物用绿色表示；未被接受的底物和预期的产物用灰色表示。(b) 代表性LCMS分析显示PP-MdpB2-PqsD菌株从5MSA产生4-羟基-6-甲基香豆素（4H6MC)。(c) 代表性LCMS分析显示PP-MdpB2-PqsD菌株从5ASA产生6A4HC。(d) 从C5-取代水杨酸产生的4H6MC和6A4HC的产率。(e) 从C4-取代水杨酸产生的4H7MC和4H7AC的产率。MdpB2-PqsD途径从C5-取代底物产生的产率高于相应的C4-取代底物，但对于甲基和氨基类似物则不然。误差条代表三次独立生物重复实验的标准偏差。（关于图中颜色参考的解释，请参阅本文的网络版本。）

3.2. 5ASA的头示意众生合成
作为利用MdpB2-PqsD模块扩展的产品空间构建从头合成途径的概念验证，我们选择了6A4HC作为示范目标，因为它可能表现出有前途的药理性质（抗炎、抗氧化和抗凝血），这些性质归因于4-羟基和6-氨基取代基的协同效应（Abazari等人，2025；Jung和Park，2009；Saadati等人，2024）。此外，其前体5-氨基水杨酸（5ASA）如先前研究所证明的那样，是一种获得FDA批准的抗炎药物（Segars和Gales，1992），用于治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病，年全球销售额超过10亿美元，但至今尚未建立5ASA的生物合成途径。
为了在P. putida中开发5ASA的从头合成途径，我们首先利用了已建立的生成水杨酸类似物的微生物途径的灵活性。鉴于这些酶能够自然地处理结构相似的化合物，我们预期它们可能会对各种氨基苯甲酸前体表现出底物亲和性。因此，我们没有选择直接将氨基引入羟基化苯甲酸骨架的途径，而是专注于寻找能够羟基化氨基苯甲酸中间体的酶，因为芳香族的羟基化在微生物代谢中是一个已经被广泛研究的转化过程（Gan等人，2025年；Ullrich和Hofrichter，2007年），而水杨酸类底物的氨基化则较为少见且研究不够充分。因此，我们根据已报道的天然活性选择了几个候选的羟基化系统。CreL是一种依赖于黄素的单加氧酶，来自克雷莫霉素（cremoomycin）的生物合成途径，它可以催化3-氨基-4-羟基苯甲酸（3,4AHBA）转化为3-氨基-2,4-二羟基苯甲酸（3,2,4ADBA）（Waldman等人，2015年）（图2a）。我们还测试了PtmB3，这是一种同样来自普拉滕西霉素（platensimycin）生物合成途径的黄素依赖型苯甲酸羟基化酶，其功能与CreL相似（Smanski等人，2011年）（图2a）。对于CreL和PtmB3，我们假设即使它们的天然底物在邻位需要一个羟基取代基，用氨基替换该羟基仍可能是可接受的，从而能够使3-氨基苯甲酸（3ABA）发生邻位羟基化，生成5-氨基水杨酸（5ASA）或3-氨基水杨酸（3ASA）。我们的第二个目标是PhgACB系统，该系统包括一个CoA连接酶PhgC、一个依赖CoA的羟基化酶PhgA和一个硫酯酶PhgB（Zhao等人，2018年）。PhgACB酶级联反应可以将4-羟基苯甲酸（4HBA）转化为龙胆酸（2,5-二羟基苯甲酸，2,5DHBA）（图2a）。在这种情况下，我们推测CoA介导的激活可能会增加底物的耐受性，使该途径能够接受3ABA，并仍然在邻位进行羟基化。我们选择的最后一个目标酶是3-羟基苯甲酸6-羟基化酶（3HB6H），这是一种依赖于黄素的单加氧酶，可以自然地将3-羟基苯甲酸（3HBA）转化为2,5DHBA（Montersino等人，2013年；Montersino和van Berkel，2012年）（图2a）。由于3ABA与天然底物3HBA仅在羟基被氨基取代这一点上有所不同，我们假设3HB6H也可能能够催化3ABA的邻位羟基化，生成5ASA。

由于这些酶可以自然地处理结构相似的化合物，我们预期它们可能会对各种氨基苯甲酸前体表现出底物亲和性。因此，我们没有选择直接将氨基引入羟基化苯甲酸骨架的途径，而是专注于寻找能够羟基化氨基苯甲酸中间体的酶，因为芳香族的羟基化在微生物代谢中是一个已经被广泛研究的转化过程（Gan等人，2025年；Ullrich和Hofrichter，2007年），而水杨酸类底物的氨基化则较为少见且研究不够充分。因此，我们根据已报道的天然活性选择了几个候选的羟基化系统。CreL是一种依赖于黄素的单加氧酶，来自克雷莫霉素（cremoomycin）的生物合成途径，它可以催化3-氨基-4-羟基苯甲酸（3,4AHBA）转化为3-氨基-2,4-二羟基苯甲酸（3,2,4ADBA）（Waldman等人，2015年）（图2a）。我们还测试了PtmB3，这是一种同样来自普拉滕西霉素（platensimycin）生物合成途径的黄素依赖型苯甲酸羟基化酶，其功能与CreL相似（Smanski等人，2011年）（图2a）。对于CreL和PtmB3，我们假设即使它们的天然底物在邻位需要一个羟基取代基，用氨基替换该羟基仍可能是可接受的，从而能够使3-氨基苯甲酸（3ABA）发生邻位羟基化，生成5-氨基水杨酸（5ASA）或3-氨基水杨酸（3ASA）。我们的第二个目标是PhgACB系统，包括一个CoA连接酶PhgC、一个依赖CoA的羟基化酶PhgA和一个硫酯酶PhgB（Zhao等人，2018年）。PhgACB酶级联反应可以将4-羟基苯甲酸（4HBA）转化为龙胆酸（2,5-二羟基苯甲酸，2,5DHBA）（图2a）。在这种情况下，我们推测CoA介导的激活可能会增加底物的耐受性，使该途径能够接受3ABA，并仍然在邻位进行羟基化。我们选择的最后一个目标酶是3-羟基苯甲酸6-羟基化酶（3HB6H），这是一种依赖于黄素的单加氧酶，可以自然地将3-羟基苯甲酸（3HBA）转化为2,5DHBA（Montersino等人，2013年；Montersino和van Berkel，2012年）（图2a）。由于3ABA与天然底物3HBA仅在羟基被氨基取代这一点上有所不同，我们假设3HB6H也可能能够催化3ABA的邻位羟基化，生成5ASA。

我们首先使用它们的天然底物确认了候选酶在体内的活性。有趣的是，即使在没有外源供应3HBA或4HBA的情况下，PP-PhgACB和PP-3HB6H菌株仍然产生了可检测的2,5DHBA，这表明P. putida可能天然就能合成少量的相关芳香族前体（补充图S1）。当向相应途径中补充3HBA或4HBA时，2,5DHBA的浓度显著增加，证实引入的途径酶在体内是活跃的（图2b；补充图S1）。然后，我们在P. putida菌株PP-CreL、PP-PtmB3、PP-PhgACB、PP-3HB6H的培养物中测试了这些候选酶，使用预测的氨基苯甲酸底物。在所检查的条件下，我们未能在含有CreL、PtmB3或PhgACB的菌株中观察到可检测的5ASA。相比之下，表达3HB6H（PP-3HB6H）的菌株在培养基中补充3ABA后产生了5ASA（图2b）。定量分析显示，当PP-3HB6H被供应200 mg/L的3HBA时，2,5DHBA的产量达到108.6 mg/L，而补充200 mg/L的3ABA则产生了125.1 mg/L的5ASA（图2c）。鉴于3ABA成功转化为5ASA，接下来我们试图构建一个从细胞代谢中从头合成3ABA的上游途径。

我们使用3-脱氢莽草酸（3DHS）作为分支点，工程化了一条将P. putida的天然莽草酸途径中间体转化为3ABA的途径。为了将3DHS转化为3ABA，我们选择了来自Streptomyces pactum的吡哆醛5′-磷酸（PLP）依赖型氨基转移酶PctV，它使用L-谷氨酸作为氨基供体催化3DHS的转氨反应（Hirayama等人，2013年）。一个经过密码子优化的pctV基因被合成并在PLLacO1启动子的控制下整合到PP. putida中，结果菌株PP-pctV从葡萄糖产生了0.64 mg/L的3ABA，证实PctV可以在该宿主体内建立一条从头合成3ABA的途径（图2d）。结合3HB6H，这条两步路线——首先将3DHS转化为3ABA，然后进行羟基化生成5ASA（图2e）——构成了从中心代谢到5ASA的完整从头合成途径。尽管最初的3ABA浓度较低，但这一结果与之前的报道一致，即微生物从头合成3ABA仍然具有挑战性（Zhang和Stephanopoulos，2016年），这可能是由于3ABA合成酶的活性有限（Hirayama等人，2013年，2015年）。值得注意的是，所达到的浓度与单一线菌株报告的最高3ABA产量相当（Zhang和Stephanopoulos，2016年），证明了这条途径在P. putida中的可行性。

在成功建立了从头合成3ABA的途径后，我们接下来尝试优化产生6A4HC的途径，以便将其与生产3ABA的菌株结合。将5ASA转化为6A4HC需要一个CoA连接酶来激活它（图3a）。因此，我们寻找了一种最佳的酶组合以实现最高效的转化。我们首先筛选了一系列CoA连接酶，包括来自Actinomadura madurae的6-甲基水杨酸-AMP连接酶MdpB2（Ling等人，2010年）；来自Streptomyces diastatochromogenes的功能相似的6-甲基水杨酸-AMP连接酶PokM3（Guo等人，2018年）；通过生物信息学分析鉴定出的潜在5-氨基水杨酸-AMP连接酶SncM（Ma等人，2025年）；以及之前提到的来自Streptomyces sp. WA 46的水杨酸-AMP连接酶SdgA（Gan等人，2025年；Lin等人，2013a）（图3a）。通过在P. putida中表达这些酶，并使用3ABA进行评估，结果发现含有CreL、PtmB3或PhgACB的菌株中没有检测到5ASA。相比之下，表达3HB6H（PP-3HB6H）并在培养基中补充3ABA的菌株产生了5ASA（图2b）。定量分析显示，当PP-3HB6H被供应200 mg/L的3HBA时，2,5DHBA的产量达到了108.6 mg/L，而补充200 mg/L的3ABA则产生了125.1 mg/L的5ASA（图2c）。鉴于3ABA成功转化为5ASA，我们接下来试图构建一个从细胞代谢中从头合成3ABA的上游途径。

利用3-脱氢莽草酸（3DHS）作为分支点，我们工程化了一条将P. putida的天然莽草酸途径中间体转化为3ABA的途径。为了将3DHS转化为3ABA，我们选择了来自Streptomyces pactum的吡哆醛5′-磷酸（PLP）依赖型氨基转移酶PctV，它使用L-谷氨酸作为氨基供体催化3DHS的转氨反应（Hirayama等人，2013年）。一个经过密码子优化的pctV基因被合成并在PLLacO1启动子的控制下整合到PP. putida中，结果菌株PP-pctV从葡萄糖产生了0.64 mg/L的3ABA，证实PctV可以在该宿主体内建立一条从头合成3ABA的途径。结合3HB6H，这条两步路线——首先将3DHS转化为3ABA，然后进行羟基化生成5ASA（图2e）——构成了从中心代谢到5ASA的完整从头合成途径。尽管最初的3ABA浓度较低，但这一结果与之前的报道一致，即微生物从头合成3ABA仍然具有挑战性（Zhang和Stephanopoulos，2016年），可能是因为3ABA合成酶的活性有限（Hirayama等人，2013年，2015年）。值得注意的是，所达到的浓度与单一线菌株报告的最高3ABA产量相当（Zhang和Stephanopoulos，2016年），证明了这条途径在P. putida中的可行性。

通过酶筛选优化6A4HC的生物合成效率，在成功建立从头合成3ABA的途径后，我们接下来尝试优化生产6A4HC的途径，以便将其与产生3ABA的菌株结合。将5ASA转化为6A4HC需要一个CoA连接酶来激活它（图3a）。因此，我们寻找了一种最佳的酶组合以实现最高效的转化。我们首先筛选了一系列CoA连接酶，包括来自Actinomadura madurae的6-甲基水杨酸-AMP连接酶MdpB2（Ling等人，2010年）；来自Streptomyces diastatochromogenes的功能相似的6-甲基水杨酸-AMP连接酶PokM3（Guo等人，2018年）；通过生物信息学分析鉴定出的假定的5-氨基水杨酸-AMP连接酶SncM（Ma等人，2025年）；以及之前提到的来自Streptomyces sp. WA 46的水杨酸-AMP连接酶SdgA（Gan等人，2025年；Lin等人，2013a）（图3a）。通过将每个候选酶与PqsD共表达，并在供应500 mg/L的5ASA后测量产生的6A4HC浓度来进行喂养实验（图3b）。虽然之前已经证明SdgA可以与PqsD在大肠杆菌中配合将水杨酸转化为4-羟基香豆素（Lin等人，2013a），但在P. putida中表达时却导致了严重的生长抑制，表明宿主不兼容问题。因此，在菌株PP-SdgA-PqsD中6A4HC的产量可以忽略不计，大部分输入的5ASA（460.6 mg/L）未被转化。尽管生物信息学预测SdgA可能对该氨基水杨酸底物具有活性（Ma等人，2025年），但菌株PP-SncM-PqsD仅产生了微量的6A4HC（1.6 mg/L）。相比之下，菌株PP-PokM3-PqsD和PP-MdpB2-PqsD对5ASA显示出显著的活性。表达PokM3的菌株消耗了96.5%的输入5ASA，产生了216.4 mg/L的6A4HC，其中17.6 mg/L的5ASA未被转化，相对于初始的500 mg/L输入，摩尔产率为37.4%。相比之下，基于MdpB2的途径几乎完全消耗了5ASA（99.6%），产生了211.4 mg/L的6A4HC，摩尔产率为36.5%。虽然基于MdpB2（216.38 mg/L）和基于MdpB2的途径（211.38 mg/L）的6A4HC浓度相当，但MdpB2显示出更强的和更稳定的5ASA消耗，表明它能够更稳健地驱动反应流程。基于这些结果，MdpB2被选为后续途径组装和优化的优先CoA连接酶。

在确定MdpB2为最佳CoA连接酶后，我们接下来研究了其他III型PKS变体是否能够提高缩合和环化步骤的催化效率。我们通过BLAST分析根据高氨基酸序列相似性鉴定了七个PqsD同源物（图3a-c）。这些同源物分别被命名为BoPqsD、CvPqsD、CsPqsD、LePqsD、MePqsD、NiPqsD、PmPqSD和PsPqsD，并分别与MdpB2在PLLacO1启动子的控制下整合到P. putida中，以评估6A4HC的产生情况。所有整合都成功，形成了菌株PP-MdpB2-BoPqsD、PP-MdpB2-CvPqsD、PP-MdpB2-LePqsD、PP-MdpB2-MePqsD、PP-MdpB2-NiPqsD和PP-MdpB2-PsPqsD，除了CsPqsD。CspqsD基因与mdpB2的整合导致了严重的生长缺陷，使得难以获得阳性克隆。当含有不同PqsD变体的菌株补充200 mg/L的5ASA时，七个同源物中有六个产生了相当量的6A4HC，范围从123.2到138.4 mg/L，而NiPqsD的活性明显降低，仅产生了33.2 mg/L的6A4HC（图3d）。我们的结果现在实验验证了这些之前仅被标记为假定的III型PKS的酶。这些变体能够在体内催化6H4AC的形成，并且可能与P. aeruginosa中的PqsD具有相似的功能。鉴于原始的PqsD已经得到了广泛的表征和验证，用于4-羟基香豆素的生物合成，我们在后续实验中选择了PqsD作为首选的PKS。

基于酶筛选的结果，我们通过结合上游的5ASA途径（PctV和3HB6H）和下游的香豆素形成模块（MdpB2和PqsD），组装了完整的从头合成6A4HC的途径，创建了菌株PP-CZ0（图4a）。出乎意料的是，菌株PP-CZ0没有产生可检测的6A4HC（图4b），这可能是由于PctV产生的3ABA浓度低（图2d）。除了PctV的活性低（Hirayama等人，2015年；Zhang和Stephanopoulos，2016年）外，这一限制也可能源于P. putida天然代谢的两个相关特征。首先，3DHS的合成依赖于莽草酸途径中的碳流，即来自磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P），然而PEP同时被中央代谢反应如丙酮酸激酶和PEP羧化酶消耗（Koendjbiharie等人，2021年；Li等人，2022年；Yu等人，2016年）。其次，3DHS本身是一个代谢分支点中间体，可能被内源酶消耗，因此可能无法积累到足以驱动异源PctV反应的水平。为了克服这些限制，我们首先针对两个主要的PEP消耗反应进行了干预：PykA将PEP不可逆地转化为丙酮酸（Schormann等人，2019年），以及Ppc将PEP转化为 Oxaloacetate（Kai等人，19第三，由于phaABC2基因簇会将多余的碳转化为聚羟基烷酸酯（PHA）以实现储存（Manoli等人，2022年），我们删除了phaABC2基因簇以限制碳向PHA储存的转移。在P. putida中，benA和benB将类似苯甲酸的芳香中间体转化为儿茶酚（Incha等人，2020年）。由于3ABA和5ASA都是芳香化合物，因此也删除了benAB基因以防止细胞可能分解这些苯甲酸衍生物。由此产生的菌株被命名为PP-CZ1（ΔbenAB Δppc::aroQ-I ΔpykA::aroQ-II ΔhexR::PLlacO1-aroG_fbr ΔPhaABC2 BL3::pctV），其3ABA积累量比親代菌株CZ0增加了13倍，浓度从0.64毫克/升增加到4.65毫克/升（图4b）。为了进一步提高3ABA的浓度，我们在PP-CZ1菌株中删除了gcd基因，得到了PP-CZ2菌株。gcd基因编码周质葡萄糖脱氢酶，该酶可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸（An和Moe，2016年）。由于野生型P. putida主要通过这条氧化途径代谢葡萄糖（Nikel等人，2015年），因此删除gcd基因预计会促使更多的葡萄糖进入细胞质磷酸化和中枢碳代谢，从而改善芳香化合物生物合成的前体供应。有趣的是，删除gcd基因（PP-CZ2）后，3ABA的产量仅略有增加（图4b），这可能表明碳供应不再是3ABA过量生产的问题。对于3ABA的合成，PctV还需要吡哆醛5’-磷酸（PLP）作为酶促反应的必需辅因子（Hirayama等人，2013年）。我们假设在高路径通量下，PLP的供应可能是限制因素，从而限制了3ABA产量的进一步提升。因此，我们将来自枯草芽孢杆菌168的pdxST基因（一个PLP生物合成模块）引入到CZ2菌株中（Wang等人，2020年）。由此产生的PP-CZ3菌株产生了7.5毫克/升的3ABA，比親代菌株提高了21倍，比CZ2菌株提高了1.7倍（图4b）。这一发现表明辅因子的供应对路径性能有额外的限制。

在培养PP-CZ3菌株期间，我们观察到了明显的棕色沉淀（补充图S2，图4b–d）。当酚类或类似儿茶酚的化合物被氧化成醌类物质，然后经过非酶促反应生成棕色色素时，可能会出现这种现象（Tilley等人，2023年）。鉴于原儿茶酸具有儿茶酚结构，因此容易受到氧化，我们推测P. putida中的QuiC可能将更多的碳流量重新导向原儿茶酸的合成（Dal等人，2005年），从而导致色素的形成。除了QuiC之外，AroE还能催化3DHS转化为莽草酸（Anton和Coggins，1988年；Chaudhuri和Coggins，1985年；Dansette和Azerad，1974年），后者是芳香氨基酸生物合成的前体。这两种反应都与PctV竞争3DHS。为了评估这些竞争分支点的各自贡献，我们分别构建了缺乏aroE和quiC的菌株。有趣的是，aroE的敲除导致生长显著抑制，因此难以获得阳性克隆，可能是由于芳香氨基酸通过莽草酸生物合成的重要性。相比之下，quiC的敲除是可以被 tolerated的。删除quiC显著减少了棕色色素的形成（补充图S2）。随后，我们整合了3HB6H和MdpB2-PqsD基因，生成了PP-CZ4菌株。PP-CZ4菌株产生了5.64毫克/升的6A4HC，培养液中剩余的3ABA不到2毫克/升（图4b–d），产率为0.0588毫克/升/小时，产物产率为0.141毫克/克葡萄糖。这些结果表明，阻断原儿茶酸的形成有效地将碳流量重新导向了6A4HC的合成。为了进一步提高6A4HC的浓度，我们在PP-CZ4菌株中引入了额外的pctV基因拷贝，得到了PP-CZ5菌株。虽然PP-CZ5菌株使6A4HC的浓度略有提高（7.56毫克/升，产率为0.079毫克/升/小时，产物产率为0.189毫克/克葡萄糖，图4d），但差异不具统计学意义，表明增加pctV的拷贝数不足以显著提高路径产量；未来需要通过代谢工程和宿主工程来进一步提高产量。

4. 讨论与结论

本研究展示了一种新的微生物生物合成途径，用于合成氨基取代的4-羟基香豆素，并鉴定了一种之前未被表征的酶活性，为5ASA的生物合成提供了新的途径。这些发现扩展了未来的香豆素途径工程所需的酶工具箱和设计逻辑。随着对可持续生产复杂芳香药物的需求增长，这里描述的模块化生物合成平台为系统性研究更多取代的4-羟基香豆素衍生物提供了验证基础。然而，这项研究也存在一些局限性。最显著的是，最终合成的6A4HC浓度仅为7.56毫克/升，远未达到工业应用的水平。为了量化这一差距，我们进行了基本的技术经济分析。由于功能性6A4HC的化学合成步骤更为复杂，我们将目标产物与结构相关的4-羟基香豆素的批量市场价格（约228美元/千克）进行了保守的对比。要实现具有竞争力的最低销售价格（MSP）228美元/千克，合成产物的浓度需要超过370毫克/升。从碳配比的角度来看，6A4HC的理论最大产率为0.655克/克葡萄糖，相当于在我们的培养条件下的约26.2克/升。尽管我们目前的浓度仅占这一理论最大值的约0.03%，但在广泛优化之前，这类概念验证平台的产量通常较低。虽然合理的宿主工程显著提高了路径性能（如3ABA积累量提高了21倍），但3ABA的绝对浓度仍然较低，表明进入该途径的碳流量仍然不足。这一限制可能源于根本的生物学限制和两个相关瓶颈。首先，3DHS是一个天然的分支点中间体，会被其他竞争途径消耗，其中包括由AroE催化的莽草酸合成途径，其敲除会显著影响细胞生长。其次，PctV是另一个瓶颈（Hirayama等人，2013年，2015年；Zhang和Stephanopoulos，2016年）。作为一种异源的PLP依赖性氨基转移酶，其在P. putida中的活性可能受到限制。此外，最大理论碳限制假设了一个无摩擦的代谢网络，而没有考虑宿主的能量代谢。P. putida天然依赖于Entner-Doudoroff（ED）途径，该途径每分子葡萄糖产生的ATP较少，而传统的Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径产生的ATP更多。这种结构上的能量缺陷自然限制了我们这一高度依赖ATP和NADPH的级联反应的生物学上限。进一步的优化可以集中在提高3DHS的有效供应上，而不影响宿主生长，筛选有效的PctV同源物，并进行潜在的蛋白质工程以提高氨基转移酶的效率。利用新兴的AI指导的蛋白质工程工具（如EvolvePro和AlphaFold），可以合理地探索像PctV这样的酶的适应性（Abramson等人，2024年；Jiang等人，2025年；Singh等人，2025年）。由于下游的3HB6H和MdpB2-PqsD模块已经表现出出色的转化效率，提高上游3ABA的供应是提高产量的关键目标。将这些计算AI设计与遗传编码的生物传感器的开发相结合，将有助于建立高通量筛选平台。这种协同策略将有助于快速识别高产的PctV变体，从而缓解这一碳供应瓶颈，提高新型生物合成平台的效率。

尽管存在这些当前的局限性，这项研究建立了一个具有重大长期意义的基础框架。即使3ABA的产量不高，但首次实现了从葡萄糖合成6A4HC的生物合成，这是一个概念上的突破，因为此前没有报道过任何微生物途径能够直接合成这种化合物或其直接前体5ASA。发现3hb6h对3ABA具有交叉活性，这本身就是一个重要的酶学发现，为5ASA（一种FDA批准的抗炎药物，主要用于治疗溃疡性结肠炎）开辟了一条全新的酶学途径（Segars和Gales，1992年）。从商业角度来看，6A4HC的衍生物Lialda在美国的年销售额接近10亿美元。因此，一个新的5ASA合成微生物平台不仅对于6A4HC的生产非常重要，也是该重要药物的另一种生产途径。6A4HC的4-羟基香豆素骨架因其药理相关性而受到广泛认可，其衍生物具有多种生物活性，包括抗凝、抗炎、抗菌和抗癌作用（Raj和Lee，2020年；Sadan等人，2025年；Vlachou等人，2022年）。尽管6A4HC本身的生物活性尚未明确，但其4-羟基香豆素骨架的药理相关性为未来研究其生物活性和治疗潜力提供了依据。MdpB2-PqsD模块能够适应多种位置的-NH2、-CH3和-OH取代基，进一步表明该平台可以用于生产多种不同的4-羟基香豆素衍生物。此外，我们还实验验证了七种假定的PqsD类似酶，并确认了它们在体内形成6A4HC的活性。总的来说，这项工作为未来的工程循环奠定了基础，使微生物生物合成成为化学合成途径的可持续替代方案。

Caiyi Zhao的贡献：撰写原始草稿、可视化、验证、项目管理、研究、正式分析、数据管理。Jingqi Hou：验证、研究。Daphne Huang：验证、方法学、研究、正式分析。Cholapat Varongchayakul：验证、资源管理、方法学。Nuojin Cheng：验证、研究。Yilin Li：正式分析、撰写-审阅与编辑。Chenyi Li：撰写-审阅与编辑、撰写-原始草稿、验证、监督、项目管理、正式分析、数据管理、概念构思。Jay D. Keasling：撰写-审阅与编辑、监督、资源获取、概念构思。