缓解克拉布特里效应以实现酿酒酵母中角鲨烯的高水平生产

《Metabolic Engineering》：Alleviating the Crabtree effect for high-level production of squalene in Saccharomyces cerevisiae

　　

•多维工程改造重编程克拉布特里效应以实现高产角鲨烯。
•克拉布特里效应重编程提高了工程菌株的角鲨烯产量。
•重构菌株比亲本菌株乙醇溢流降低 32%，ATP 含量高 2.5 倍。
•在 50 升补料分批发酵中实现了创纪录的 57.2 g/L 角鲨烯滴度。

1. 引言
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种公认安全（GRAS）的生物体，是工业生物技术的基石；它被广泛用于乙醇发酵、重组蛋白生产和药用化合物合成（Sun 等，2026；X. Chen 等，2022a；Liang 等，2025）。尽管地位显赫，酿酒酵母的工业潜力从根本上受到一种称为克拉布特里效应（Crabtree effect）的葡萄糖诱导代谢现象的制约（Manoj 等，2025）。该效应的特征是当葡萄糖浓度超过约 0.15 g/L 的阈值时，在好氧条件下转变为发酵代谢，这是一种进化适应，导致 60–75% 的碳通量大量重新定向至乙醇形成（Pfeiffer 和 Morley，2014；Yatabe 等，2022）。在克拉布特里效应开始时，糖酵流通量的快速激活驱使丙酮酸重新分配至乙醇发酵，从而损害线粒体三羧酸（TCA）循环代谢，进而 impair 呼吸能量保存和非乙醇产物的前体供应（Chen 等，2025）。这种代谢重编程有三个主要后果：(i) 显著的碳损失，高达 30% 的输入葡萄糖被分流至挥发性副产物；(ii) 与完全呼吸代谢相比，ATP 产量大幅减少约 9 倍；以及 (iii) 三羧酸（TCA）循环中间产物的关键耗竭，这些中间产物是广泛非乙醇代谢物的必需前体（Gonzalez 等，2021；Pfeiffer 和 Morley，2014；Frick 和 Wittmann，2005）。

这些固有的生理限制即使在基因工程菌株中依然存在，直接破坏了生物加工效率。在工业环境中，高细胞密度培养通常需要高葡萄糖补料（Kildegaard 等，2016）。然而，在酿酒酵母中，这种常见做法悖论式地触发了克拉布特里效应，导致呼吸代谢受到抑制（Liang 等，2024）。随之而来的代谢溢流不仅造成 ATP 生产效率低和生长缓慢，还严重损害了依赖功能性 TCA 循环和呼吸能量保存的目标产物合成。这种限制在乙酰辅酶 A 衍生化合物（如萜类和合成需要高效呼吸代谢的其他高价值化学品）的次优生产中尤为明显（Meng 等，2025；Wang 等，2025；Deng 等，2025）。此外，积累的乙醇在达到超过细胞耐受阈值的浓度时变得具有抑制性，从而进一步损害细胞活力和产品滴度。因此，绕过克拉布特里效应仍然是利用酿酒酵母——一种在工业微生物中拥有最先进基因工具包的生物体——进行多样化生物化学品高产量生产的一个关键且长期的挑战（Kildegaard 等，2016）。

在过去十年中，针对克拉布特里效应对酿酒酵母非乙醇代谢物生物合成所施加的限制，已取得显著进展。Dai 等人通过建立一种替代丙酮酸脱氢酶旁路，结合一种不依赖 ATP 的乙酰辅酶 A 合成途径和适应性实验室进化，开发了一种工程克拉布特里阴性菌株，在纯呼吸条件下实现了与野生型菌株相当的呼吸生长速率（0.218 h?1）（Dai 等，2018）。Chen 等人实施了一种双重遗传策略，涉及删除编码蛋白磷酸酶 1 调节亚基的 REG1 和过表达编码 SNF1 复合物催化亚基的 SNF1，通过减少葡萄糖抑制来减轻克拉布特里效应，从而将代谢通量重新定向至目标产物 S-腺苷-L-甲硫氨酸（Chen 等，2022b）。Zhang 等人采用了一种转录工程方法，靶向转录调节因子 MTH1 和 RNA 聚合酶 II 调节因子 MED2，通过增强呼吸代谢来逆转克拉布特里效应，从而提高了 3-羟基丙酸的产量（Zhang 等，2022）。除酿酒酵母外，类似的碳溢流约束也已在白腐酵母（Yarrowia lipolytica）中通过协调调节糖酵流通量和碳抑制得到缓解，从而实现了无溢流的高水平β-法尼烯生产（Liu 等，2026）。虽然这些研究成功靶向了离散的代谢模块，包括糖酵调节、葡萄糖感知机制和转录控制系统，但几个关键方面仍未得到充分解决。SNF1/AMPK 是细胞能量的核心调节器和发酵与呼吸之间代谢切换的总调节器，在减轻克拉布特里效应的背景下尚未得到系统研究（Herzig 和 Shaw，2018）。此外，线粒体生理功能在维持呼吸抑制期间的能量稳态、氧化还原平衡和前体供应方面的作用在很大程度上被忽视了（Malina 等，2021）。同样重要的是，代谢稳健性与乙醇积累和氧化还原不平衡所触发的应激反应之间的相互作用也知之甚少，这两者都是克拉布特里效应的后果。这些知识空白强烈表明，未来的工程策略应采用综合方法，靶向碳通量优化、线粒体增强和改善应激耐受性。这些方法为在酿酒酵母中高效生产非乙醇产物提供了有前景的途径。

基于这一背景，我们提出了一种系统的代谢工程框架，通过多维途径优化来解决酿酒酵母中的克拉布特里效应，并以角鲨烯生物合成为代表性案例研究（Hu 等，2026）。选择这种高价值三萜类化合物是因为其对能量（ATP）和前体（乙酰辅酶 A/NADPH）有严格的生物合成需求，这放大了克拉布特里效应所施加的代谢限制，包括有限的呼吸能力和受损的能量代谢（Son 等，2022；Zhu 等，2021）。我们的综合方法结合了四项关键干预措施：(1) 调节葡萄糖感知网络以减轻碳分解代谢物抑制，(2) 全局代谢的转录调节，(3) 增强线粒体氧化磷酸化，以及 (4) 巩固细胞应激防御。所开发的框架建立了一种通用范式，用于将克拉布特里阳性酵母工程化为通用细胞工厂，特别是用于生产乙醇发酵之外的能源密集型化合物。

2. 材料与方法
2.1. 菌株、培养基和培养条件
菌株构建过程的流程图见图 S1，本研究使用的酵母菌株完整列表见表 S1。酵母菌株在酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（2% 葡萄糖，2% 蛋白胨和 1% 酵母提取物）中培养，而重组大肠杆菌则在补充了 100 μg/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani 肉汤中培养。为了筛选酵母菌株，携带 pitch 质粒（Cas9 蛋白表达质粒）的转化体在 SD-Leu 培养基（合成缺失培养基，含 2% D-葡萄糖，缺乏亮氨酸）上筛选。携带 pTCL 和向导 RNA（gRNA）质粒的菌株在 SD-Leu-Ura 培养基（缺乏亮氨酸和尿嘧啶）上筛选。为了消除 gRNA 表达质粒，菌株在 SD-Leu-5-FoA 培养基（SD-Leu 补充 1 mg/mL 5-氟尿嘧啶）上进一步筛选。所有 SD 培养基均购自 FunGenome（中国北京）。本研究使用的亲本菌株为 SquMC13，这是本实验室先前开发的一种生产角鲨烯的酿酒酵母菌株（Zhu 等，2021）。

2.2. 质粒构建
本研究使用的质粒和引物分别列在表 S2 和表 S3 中。所有 DNA 序列均使用 KOD FX101 高保真聚合酶（日本大阪 TOYOBO）扩增。质粒组装使用 Gibson 一步克隆系统（中国南京 Vazyme）进行。靶向特定基因组位点的 gRNA 质粒是使用 CRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp/）设计，并通过 PCR 和插入式克隆构建的。

2.3. 酵母菌株构建
为了构建菌株，将扩增的上游和下游同源臂以及含有至少 40 bp 与同源臂重叠的基因盒共同转化到酿酒酵母中，使用 Frozen-EZ 酵母转化 II 试剂盒（美国加利福尼亚州欧文 Zymo Research）。转化后的细胞随后被接种到 SD-Leu-Ura 固体培养基上，培养 2–3 天。为了实现连续基因编辑，随后将工程菌株交叉划线到 SD-Leu-5-FoA 平板上以去除 gRNA 质粒。

2.4. 工程酵母的摇瓶培养
工程酵母菌株在含有 50 mL YPD 培养基的 250 毫升摇瓶中培养。首先将单菌落接种到 5 mL YPD 培养基中，在 30°C、220 转/分振荡条件下培养 12 小时。然后将培养物转移到 15 mL YPD 培养基中，调整至初始 600 nm 处光密度（OD600）为 0.1，并在相同条件下培养约 14 小时。随后，将此种子培养物接种到 50 mL 新鲜 YPD 培养基中，初始 OD600 为 0.2，在 30°C、220 转/分振荡条件下培养约七天。

2.5. 角鲨烯提取和定量
为了提取角鲨烯，将 600 μL 培养样品与 600 μL 乙酸乙酯和 1.5 克氧化锆珠（0.5 毫米直径）混合在 2 毫升微量离心管中。混合物使用冷冻研磨机（中国上海，上海景新）在 55 赫兹和 4°C 下处理 30 分钟。随后，样品在 12,000 转/分下离心 10 分钟，收集上层有机相，用无水硫酸钠脱水，并用于气相色谱（GC）。GC 系统（7890A；美国加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦技术）配备了 HP-5 色谱柱（30 米 × 0.25 毫米，0.25 微米膜厚）和氢火焰离子化检测器。炉温保持在 290°C 8 分钟，保留时间为 3.8 分钟。角鲨烯通过外标法定量。结果报告为三次重复的平均值。

2.6. 乙醇含量测定
首先将单菌落接种到 5 mL YPD 培养基中，在 30°C、220 转/分振荡条件下培养 12 小时。随后，培养物转移到 15 mL YPD 培养基中，调整至初始 OD600 为 0.1，并在相同条件下培养约 14 小时。最后，将菌株接种到 50 mL YPD 培养基中，在 30°C、220 转/分振荡条件下培养（直至培养基中葡萄糖耗尽），并使用乙醇含量检测试剂盒（中国北京，Solarbio）进行检测。

2.7. ATP 含量测定
使用基于萤火虫荧光素酶的 ATP 检测试剂盒（中国上海，Beyotime），按照制造商的说明测定细胞内 ATP 水平。在 ATP 定量之前，将细胞悬液标准化至相同的 OD600。生成标准曲线，ATP 浓度以纳摩尔（nM）表示。

2.8. NADPH/NADP+ 比值测定
使用商用辅酶 II (NADP+/NADPH) 检测试剂盒（中国南京，南京建成生物工程研究所），按照制造商的方案测定细胞内 NADPH/NADP+ 比值。

2.9. 实时定量 PCR 分析
使用商用 RNA 提取试剂盒（Vazyme）从酿酒酵母菌株中提取总 RNA，按照制造商的说明操作。纯化的 RNA 经 dsDNase 处理，随后使用 UnionScript 第一条链 cDNA 合成试剂盒（中国，Jinsha）逆转录为第一条链 cDNA。使用基于 SYBR 的 qPCR 预混液在实时 PCR 检测系统上进行实时定量 PCR（qPCR）分析。每种条件分析三个生物学重复。基因表达水平以内部参考基因 ACT1 的值为标准进行归一化，并使用 2–ΔΔCt 方法计算相对转录本丰度。

在确定培养条件下进行 RT-qPCR 分析时，将工程菌株培养在补充了 2 g/L 亮氨酸以满足菌株营养缺陷型需求的亮氨酸缺失合成培养基（SC-Leu；中国北京，北京磐金诺生物技术）中。培养物在 30°C、200 转/分振荡条件下培养至对数生长期中期，然后提取 RNA。

2.10. 线粒体膜电位评估
线粒体膜电位（Δψm）是融合和分裂动态过程中线粒体质量的重要指标，使用四甲基罗丹明乙酯染色（Beyotime）进行评估，按照制造商的说明操作。

2.11. 通过激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体形态
使用 AIR 共聚焦激光扫描显微镜（日本东京，Nikon）通过激光扫描共聚焦显微镜观察工程菌株的线粒体形态变化。细胞在 YPD 培养基中培养 24 小时，并通过离心收集。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次后，将细胞重悬于 PBS 中。PBS 配方包含 10 mM Na2HPO4，2 mM NaH2PO4，135 mM NaCl 和 4.7 mM KCl，pH 调整至 7.4。线粒体绿色荧光在 488 纳米波长下激发，并使用相应的发射通道检测。

2.12. 细胞内活性氧水平测定
使用荧光探针 2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）测定细胞内活性氧（ROS）水平。简要方法如下：通过 8000 转/分离心 5 分钟收集 1 mL 酵母培养物，并弃去上清液。细胞沉淀用 PBS（pH 7.4）洗涤两次。洗涤后，将细胞重悬于 990 μL PBS 中，随后加入 10 μL 10 mM DCFH-DA 溶液。轻轻混合悬浮液，并在黑暗条件下 30°C 培养 30 分钟。随后，再次用 PBS（pH 7.4）洗涤细胞以去除多余的探针。

从细胞悬浮液中取200 μL移入黑色96孔微孔板中，使用酶标仪测量荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。在计算OCR之前，从样品孔的荧光值中减去空白孔的荧光值。

**2.13 耗氧速率（OCR）的测定**

使用荧光法OCR检测试剂盒（Elabscience，中国武汉）按照制造商的说明测定细胞的耗氧速率（OCR）。简要步骤如下：每个孔中加入100 μL工作液，在37°C下孵育30分钟，随后加入80 μL试剂2以建立密封的检测环境。然后使用酶标仪在动力学模式下于37°C监测荧光信号，激发波长和发射波长分别设置为405 nm和675 nm。每2分钟记录一次数据，持续90分钟。根据荧光-时间曲线线性稳定期的平均荧光强度计算基础OCR。在计算OCR之前，从样品孔的荧光值中减去空白孔的荧光值。OCR值根据对应的OD600值进行归一化，以考虑不同菌株间细胞生物量的差异。

**2.14 线粒体呼吸链复合物IV活性的测定**

按照制造商的说明使用线粒体呼吸链复合物IV活性检测试剂盒（Solarbio，中国北京）测定线粒体呼吸链复合物IV的活性。简要步骤如下：在冰浴条件下收集细胞并用裂解缓冲液进行裂解，随后通过差速离心获得线粒体组分。然后使用相应的检测试剂盒通过分光光度法测定复合物IV活性，酶活性根据蛋白质浓度进行归一化。

**2.15 补料分批发酵**

补料分批发酵所使用的培养基由20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、8 g/L KH?PO?、3 g/L MgSO?、0.72 g/L ZnSO?·7H?O、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液组成。在补料分批发酵中，选取一个单菌落，在5 mL YPD培养基中以220 rpm和30°C培养18小时。然后，将1 mL种子液转入装有15 mL YPD培养基的250 mL锥形瓶中，在220 rpm、30°C的旋转振荡器中培养12小时。接着，将5 mL培养物转入装有100 mL YPD培养基的500 mL锥形瓶中，在220 rpm、30°C的旋转振荡器中培养12小时。补料分批发酵在50 L生物反应器（百仑，中国上海）中进行。使用氨水将pH维持在5.0至5.5之间，溶解氧浓度维持在30%。当OD600达到约140时，在指数生长期加入7 g/L半乳糖诱导角鲨烯合成。组间统计学显著性采用双尾非配对Student's t检验分析（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。所有数据均代表至少三个独立样本的平均值，误差线表示标准差。

**3. 结果与讨论**

**3.1 通过调控SNF1/AMPK能量感受器缓解Crabtree效应**

葡萄糖抑制（分解代谢物阻遏）是Crabtree效应的关键分子机制；它抑制参与呼吸和替代碳源利用的基因（Herzig and Shaw, 2018; Jiang et al., 2000）。这种抑制主要通过抑制Snf1/AMPK复合物来实现，该复合物是激活呼吸途径所必需的核心能量感受器（Jiang et al., 2000）。Snf1的活性依赖于其调节亚基Snf4，并且在葡萄糖存在时被抑制（图1A）（Ke et al., 2023; Schüller, 2003; Celenza and Carlson, 1989）。从机制上看，这种抑制是通过Glc7–Reg1蛋白磷酸酶1（PP1）复合物对Snf1的去磷酸化来实现的，其中Reg1作为靶向亚基将Glc7招募至Snf1（Ludin et al., 1998; Zhang et al., 2015）。因此，通过恢复Snf1活性来解除葡萄糖抑制，有望减轻Crabtree效应并改善细胞能量状态，从而有利于角鲨烯生物合成。

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**图1. 修饰Snf1/AMPK系统对C01–C08菌株Crabtree效应和角鲨烯生产的影响。**（A）酿酒酵母中Snf1/AMPK信号传导、葡萄糖抑制与Crabtree效应之间的假定调控网络。Snf1复合物通过1型蛋白磷酸酶（PP1）复合物Glc7–Reg1的去磷酸化作用而被灭活。激活后，Snf1p被磷酸化，从而抑制Mig1p，解除其对编码己糖转运蛋白（HXTs）基因转录的抑制。通过HXTs的葡萄糖转运调节糖酵解通量，从而影响呼吸与发酵之间的代谢切换。（B）单独Snf1/AMPK相关基因修饰对角鲨烯产量和生物量的影响。"?"表示未进行基因修饰。（C）菌株SquMC13和C01–C08在葡萄糖消耗期结束时角鲨烯滴度和乙醇积累量。（D）C01、C05和C06菌株中葡萄糖转运、发酵和呼吸相关基因的相对转录水平，通过RT-qPCR测定。基因表达以ACT1为内参基因归一化，并使用2?ΔΔCt法进行定量，以SquMC13作为校准菌株。（E）C06菌株中参与糖酵解、乙醇代谢、TCA循环和线粒体电子传递链的关键基因转录水平的综合可视化。（F、G）SquMC13、C05、C06、C07和C08菌株在指数生长期中期ATP含量（F）和NADPH/NADP?比值（G）的变化。

根据先前的报道，删除编码PP1调节亚基的REG1基因可以减弱Glc7对Snf1的灭活作用，从而缓解葡萄糖抑制，该调节亚基将Glc7定向至葡萄糖抑制靶标（Ludin et al., 1998）。基于此原理，我们从SquMC13菌株中删除了REG1，以期降低Glc7活性并缓解葡萄糖抑制。所得C01菌株的角鲨烯滴度为3.1 ± 0.1 g/L，比亲本SquMC13菌株（2.7 ± 0.1 g/L）提高了14.8%，这与我们的设计预期一致（图1B）。

为验证葡萄糖抑制和Crabtree效应是否得到缓解，我们定量检测了Snf1依赖性呼吸基因（ICL1、FBP1和CIT1）的表达，并测量了残余乙醇浓度（Kayikci and Nielsen, 2015）。与SquMC13相比，C01菌株中ICL1、FBP1和CIT1的转录本丰度降低，分别降至亲本水平的45%、58%和53%。同时，乙醇积累量降低了4.43%（图1C–E）。这些数据表明，尽管C01中乙醇产量略有降低，但呼吸基因的转录并未上调。综合来看，这些结果表明在测试条件下C01中葡萄糖抑制和Crabtree表型的缓解仍然有限。单独删除REG1未能完全重新激活Snf1介导的呼吸途径，但仍对碳代谢和角鲨烯合成产生了边际改善。

为进一步探究Snf1复合物对Crabtree效应的调控影响，我们在SquMC13中过表达了SNF1（C02菌株）、SNF4（C03菌株）以及两者同时过表达（C04菌株）。所得C02和C04菌株的角鲨烯滴度分别提高至3.1 ± 0.2 g/L（增加14.8%）和2.9 ± 0.2 g/L（增加7.41%），而C03菌株与SquMC13相比下降了3.7%（图1B）。这些结果表明，在高糖条件下激活催化亚基Snf1（而非其调节伙伴Snf4）是解除葡萄糖抑制和促进呼吸代谢所必需的，从而有利于呼吸代谢和萜类化合物生物合成。

由于Snf1/AMPK复合物的激活仅部分解除了葡萄糖抑制，我们检测了将葡萄糖信号传递至转录抑制因子的上游因素。己糖激酶Hxk2以及转录抑制因子Mig1、Mig2和Mig3构成了葡萄糖抑制通路的主要组成部分，它们作用于葡萄糖感知与转录调控的界面（图1A）（Scheffler et al., 1998; Herwig et al., 2002）。在这些因素中，Hxk2具有双重作用，不仅作为糖酵解酶，还作为葡萄糖抑制的关键调节因子，通过促进Mig1介导的转录抑制发挥作用（Vega et al., 2016）。作为该抑制的主要效应因子，Mig1结合于葡萄糖可抑制基因的启动子上（如GAL簇基因），以抑制其转录（Westholm et al., 2008; Nehlin et al., 1991）。此外，酵母细胞含有两种相关的锌指蛋白Mig2和Mig3，它们对部分葡萄糖可抑制基因子集发挥较弱或条件依赖性的抑制作用（Westholm et al., 2008; Lutfiyya et al., 1998）。基于葡萄糖抑制对Crabtree效应贡献显著这一观察结果，我们选择了四个主要调节因子——Hxk2、Mig1、Mig2和Mig3——在SquMC13中进行靶向失活，从而产生了相应的C05–C08菌株。

在高葡萄糖条件（2%葡萄糖）下，Hxk2与Mig1协同激活低亲和力葡萄糖转运蛋白Hxt1，同时抑制高亲和力转运蛋白Hxt2和Hxt4。删除HXK2（C05菌株）使角鲨烯滴度提高了16.5%，并伴随特征性的葡萄糖去抑制转录变化（图1B）。RT-qPCR分析进一步显示，HXT1的表达水平显著上调至对照的2.54倍，而HXT2的表达也上调至对照的1.51倍。相比之下，HXT4的表达降至对照的81%（图1D）。这些结果表明，在高糖条件下HXK2删除改变而非简单逆转了经典的葡萄糖抑制模式。HXT1表达增加以及HXT2和HXT4的差异调节表明葡萄糖摄取和碳代谢发生了部分重塑。这些发现表明HXK2删除部分影响了葡萄糖抑制相关的调控，并有助于改善角鲨烯生物合成。

删除主要抑制因子Mig1（C06菌株）使角鲨烯产量提高了30%，细胞内ATP和NAD(P)H/NAD(P)?水平分别升高了46.9%和20.2%（图1F和G）。转录水平分析揭示C06菌株中中心碳代谢发生了广泛重塑。在发酵和糖酵解相关基因中，PDC1的表达上调至对照的1.51倍，而ADH1和ENO2分别显著上调至对照的4.54倍和6.28倍，表明糖酵解通量和下游氧化还原代谢活性增强（图1D和E）。与线粒体能量代谢相关的基因也表现出显著的转录变化。RT-qPCR分析显示CIT1的表达降至对照的30%，而SDH2和COX4的表达水平分别显著上调至对照的5.45倍和5.85倍（图1D和E）。SDH2和COX4均参与线粒体呼吸代谢和电子传递，它们的强烈上调表明尽管CIT1表达降低，但与呼吸相关的代谢活性有所增强。

综合来看，这些结果表明MIG1删除并非简单地将代谢从发酵重新导向呼吸，而是部分缓解了葡萄糖抑制并广泛激活了糖酵解和呼吸代谢途径。这种协调的代谢重塑可能有助于改善细胞内能量供应和还原力可用性，从而支持角鲨烯生物合成的增强。为进一步评估MIG1删除表型在定义营养条件下的稳健性，我们在SC培养基中评估了C06菌株（图S2A和B）。相比之下，MIG2删除（C07菌株）严重损害了生长和角鲨烯合成，而MIG3删除（C08菌株）仅产生轻微改善，这与它们作为碳通量次要或条件特异性调节因子的作用一致。这些结果表明，选择性解除葡萄糖抑制（尤其是通过MIG1删除）可改善细胞内能量和还原力的可用性，为角鲨烯生物合成提供更有利的代谢支持。

基于上述结果，我们在SquMC13中对SNF1、HXK2、REG1和MIG1进行了组合修饰，分别产生了C09–C12菌株。其中，C12菌株过表达了SNF1并携带REG1和MIG1删除，角鲨烯产量改善最为显著（3.8 ± 0.03 g/L），比SquMC13提高了40.7%（图2A）。该改善伴随着指数生长期ATP水平上升58.12%、NADPH/NADP?比值增加20.69%以及残余乙醇浓度降低7.61%（图2B–D）。在酿酒酵母中，葡萄糖抑制会抑制呼吸基因表达并促进发酵代谢；因此，C12菌株中ATP和NADPH的增加表明葡萄糖抑制得到解除，代谢向呼吸方向转变。乙醇浓度的下降幅度显著低于ATP水平和NADPH/NADP?比值的增加幅度。为进一步表征与Crabtree效应减弱相关的生理变化，我们在YPD培养基的摇瓶培养过程中分析了葡萄糖消耗、乙醇积累/再同化、细胞生长和角鲨烯生产的时间进程曲线（图2E和F）。为评估这些生理反应是否依赖于培养基组成，我们在SC培养基中也进行了相同的时间进程分析（图S2C和D）。

与亲本菌株SquMC13相比，菌株C12表现出相似的葡萄糖消耗模式，但在早期发酵阶段乙醇积累较低。与此同时，菌株C12在整个发酵过程中维持了改善的生物量积累并持续增加角鲨烯产量。这些动态生理特征表明，SNF1/AMPK相关调控模块的调节部分缓解了葡萄糖抑制并促进了更具呼吸许可性的代谢状态。为确认这一点，我们进行了RT-qPCR分析，结果显示菌株C12存在广泛的转录重塑。在呼吸和TCA循环基因中，COX4、SDH2和CIT1的表达水平相对于对照分别上调至3.63倍、2.57倍和2.91倍。与此同时，发酵基因也表现出显著上调，PDC1、ENO2和ADH1分别增加至5.62倍、6.64倍和3.47倍。这些结果表明，SNF1/AMPK相关调控模块的调节广泛激活了中心碳代谢，同时增强了呼吸相关代谢，而并未完全抑制发酵活性。这种协调的代谢重塑可能有助于为角鲨烯生物合成提供增强的能量和前体供应（图2G和H）。为进一步评估葡萄糖抑制的解除，分析了菌株SquMC13、C01、C02和C12中经典葡萄糖可抑制基因SUC2和PCK1的转录水平。与SquMC13相比，PCK1表达从C01菌株中的67%分别增加到C02和C12菌株中的1.26倍和2.03倍，其中C12菌株中表达量最高。与此同时，SUC2表达也呈现整体上升趋势，从C01菌株中的38%分别增加到C02和C12菌株中的80%和60%。这些结果进一步支持了通过调节SNF1/AMPK相关调控模块部分缓解葡萄糖抑制（图2I）。

图2. 修改Snf1/AMPK系统对C09–C12菌株中Crabtree相关表型和角鲨烯产量的影响。（A）联合Snf1/AMPK相关基因修饰对角鲨烯产量和生物量的影响。（B–D）菌株SquMC13和C12在对数生长中期的ATP含量（B）、NADPH/NADP+比值（C）和乙醇积累（D）的变化。（E、F）菌株SquMC13和C12在培养过程中的葡萄糖消耗和乙醇积累/再同化（E），以及生物量形成和角鲨烯产量（F）的时间进程曲线。（G）通过RT-qPCR测定菌株C12中葡萄糖转运、发酵和呼吸基因的相对转录水平。（H）菌株C12中参与糖酵解、乙醇代谢、TCA循环和线粒体电子传递链的关键基因转录水平的整合可视化。（I）菌株C01、C02和C12中经典葡萄糖可抑制基因SUC2和PCK1的相对表达水平。基因表达水平以亲本菌株SquMC13为基准进行标准化。基因表达以ACT1为参照进行标准化，并使用2?ΔΔCt法进行定量，以SquMC13作为校准菌株。柱状图表示相对于对照的倍数变化，误差线表示三个生物学重复的标准差。

总之，上述结果表明葡萄糖抑制的解除、Crabtree效应的减弱和角鲨烯生物合成的增强之间存在生理关联。同时，这些发现提供了一种有效的策略来缓解酿酒酵母中的Crabtree效应以提高角鲨烯产量，这是通过改变碳代谢所伴随的ATP/NADPH生成增加和乙酰辅酶A可用性提高来实现的。

3.2. 通过转录和代谢调节因子缓解Crabtree效应

除了主要调节因子Snf1/AMPK之外，其他转录和代谢调节因子也被证明与Crabtree效应有关，对其进行靶向修饰为缓解Crabtree效应并提高非乙醇产品的合成提供了策略（图3A）。例如，Dai等人证明，通过引入MED2*432Y（RNA聚合酶II中介复合物的突变亚基）和GPD1W71*（甘油-3-磷酸脱氢酶的突变体），可以在丙酮酸脱羧酶缺陷的酿酒酵母菌株（ΔPDC1 ΔPDC5 ΔPDC6）中进行全局代谢重连，从而恢复生长并恢复代谢稳健性，从而建立了一种Crabtree阴性样的生理状态（Dai et al., 2018）。类似地，Zhang等人证明，MTH1A81D突变（编码葡萄糖信号调节因子Mth1的突变体）通过调节葡萄糖摄取和激活呼吸代谢减弱了葡萄糖抑制，增强了能量供应和乙酰辅酶A生物合成，从而促进了非乙醇产品的合成（Zhang et al., 2022）。先前的研究表明，广泛的代谢重连可以显著改变酿酒酵母的原生呼吸-发酵代谢，突出了在Crabtree效应相关条件下酵母中心碳代谢的可塑性（Yu et al., 2018）。

图3. MED2*432Y、GPD1W71*和MTH1A81D突变对酿酒酵母中Crabtree效应和角鲨烯产量的影响。（A）MED2*432Y、GPD1W71*和MTH1A81D在碳通量调节中作用的示意图。（B）菌株C13、C14和C15在角鲨烯产量和生物量方面的表现。"—"表示未进行遗传修饰。（C、D）菌株C12和C15在对数生长中期的ATP浓度（C）和NADPH/NADP+比值（D）差异。（E、F）菌株C12和C15在培养过程中葡萄糖消耗和乙醇积累/再同化（E），以及生物量形成和角鲨烯产量（F）的时间进程曲线。（G）菌株C12中MED2*432Y、GPD1W71*和MTH1A81D联合修饰对乙醇积累的影响。（H）菌株C15中葡萄糖可抑制和呼吸相关基因ICL1、FBP1、SUC2和PCK1的相对表达水平。基因表达水平以亲本菌株SquMC13为基准进行标准化。基因表达使用2?ΔΔCt法以ACT1作为内参基因进行定量。误差线表示三个生物学重复的标准差。

为评估这些突变是否能够通过减轻Crabtree效应来促进角鲨烯产量，我们在菌株C12中分别将内源的MED2、GPD1和MTH1基因替换为突变等位基因MED2*432Y、GPD1W71*和MTH1A81D，分别产生了衍生菌株C13、C14和C15。与C12菌株的3.8 ± 0.1 g/L相比，C13、C14和C15菌株的角鲨烯产量分别显著增加了5.3%（4.0 ± 0.1 g/L）、10.5%（4.2 ± 0.1 g/L）和10.5%（4.2 ± 0.1 g/L）（图3B）。值得注意的是，尽管产量提高，这些菌株在培养过程中的最大生物量相对于C12显著降低，表明所引入的转录和代谢调节变异体（MED2*432Y、GPD1W71*和MTH1A81D）显著改变了细胞代谢状态。由于乙醇积累是Crabtree效应的标志性特征，这种减少意味着发酵溢流得到缓解并向氧化代谢转变。与此一致的是，C15中ATP（提高18.61%）和NADPH/NADP+（提高6.88%）水平的升高支持了呼吸活性的增强和发酵溢流的减少（图3C和D）。

为进一步表征MTH1A81D突变的生理效应，我们分析了菌株C12和C15在YPD培养基（图3E和F）和SC培养基（图S3A和B）中进行摇瓶培养时葡萄糖消耗、乙醇积累/再同化、生物量形成和角鲨烯产物的时间进程曲线。在乙醇产生阶段，C15积累的乙醇少于C12，且其乙醇浓度在培养后期下降更快。与此趋势一致，C15的乙醇峰值比C12低17.23%（图3G）。值得注意的是，C15产生的生物量较少，但实现了更高的最终角鲨烯滴度（图3F）。这些生理动态表明，MTH1A81D突变部分缓解了与Crabtree效应相关的发酵溢流，并促进了代谢状态向更偏呼吸方向的适度转变，从而改善了用于角鲨烯生物合成的碳和能量利用。为验证菌株C15中葡萄糖抑制的解除，我们进行了代表性葡萄糖可抑制基因和呼吸相关基因的RT-qPCR分析。与菌株SquMC13相比，ICL1、FBP1、SUC2和PCK1的表达水平分别上调至3.17倍、5.91倍、2.78倍和9.03倍（图3H）。在这些基因中，SUC2和PCK1是葡萄糖抑制解除的经典标志物，而ICL1和FBP1则与糖异生和替代碳代谢有关。这些基因的协调上调进一步支持了MTH1A81D突变部分缓解了葡萄糖抑制并减少了菌株C15中与Crabtree效应相关的发酵溢流。

基于上述结果，我们将这三个调节变异体组合整合到菌株C12中，产生了菌株C16–C19。与我们的预期相反，这些调节变异体的同时整合未能进一步提高角鲨烯产量，反而导致生物量相对于C12显著减少（图S4A），表明单独Crabtree相关突变所观察到的有益效应在组合水平上并非协同加性。值得注意的是，在组合菌株中，只有C17表现出乙醇积累的显著减少，降低了33.8%（图S4B）。这一结果可能反映了全局代谢调节的内在复杂性，因为多个调节节点的同时扰动可能会破坏细胞稳态并抵消减轻Crabtree效应的优势。因此，选择了角鲨烯产量提高11.13%且乙醇积累降低17.23%的菌株C15（MTH1A81D）进行进一步工程改造。

3.3. 通过增强线粒体呼吸功能缓解Crabtree效应

线粒体呼吸的抑制是Crabtree效应的关键表现。在高葡萄糖条件下，代谢调节约束了TCA循环并损害了线粒体呼吸功能，从而将碳通量通过糖酵解重定向至乙醇，限制了细胞生长，进而损害了非乙醇代谢物的合成（Perez-Samper et al., 2018）。本研究使用的亲本角鲨烯高产菌株（SquMC13）是一个线粒体工程菌株。与未修饰的亲本菌株相比，SquMC13表现出受损的线粒体功能，表现为线粒体形态聚集和电子传递链（ETC）受损。在高葡萄糖发酵条件下，Crabtree效应加剧了这种线粒体功能损害，从而由于细胞生长受损和ATP及NADH供应不足而阻碍了角鲨烯产量的显著提高（Son et al., 2022）。鉴于角鲨烯合成是一个能量密集型过程（Tang et al., 2025），提高菌株的生产能力需要提高ATP和NADH的可用性。实现这一目标需要绕过Crabtree效应介导的线粒体呼吸能力抑制并优化线粒体功能。

在酿酒酵母中，Hap2/3/4/5p转录激活复合体主要通过其Hap4p亚基在Crabtree效应的葡萄糖介导调节下控制呼吸代谢（图4A）（Blom et al., 2000）。为缓解这种呼吸抑制，我们在C15菌株中过表达HAP4，产生了菌株C20。与C15相比，C20的角鲨烯滴度增加了2.4%至4.3 ± 0.1 g/L（图4B）。然而，这一干预措施效果有限。因此，我们通过修饰ETC来优化线粒体呼吸功能以增强角鲨烯生物合成。在酿酒酵母中，细胞色素c氧化酶（复合体IV）是ETC的终端氧化酶，在决定呼吸电子通量方面发挥关键作用（Geldon et al., 2021）。复合体IV的核心由三个线粒体编码的亚基组成，即Cox1p、Cox2p和Cox3p，它们的翻译和组装受到一组特异性核编码因子的严格控制（Dennerlein et al., 2023）。每个线粒体mRNA的翻译由特异性核编码激活因子调节：COX1由Mss51p和Pet309p调节；COX2由Pet111p调节；COX3由Pet54p、Pet122p和Pet494p调节（Naithani et al., 2003）。在这些因子中，Mss51p作为线粒体翻译的主调节因子，而Pet309p是一种具有N端五肽重复基序的内膜蛋白，稳定COX1 mRNA以促进翻译起始。Pet111p定位于内膜的基质面，而Pet54p作为外周膜蛋白发挥作用。Pet122p和Pet494p都是内膜相关因子，在过表达时表现出整合膜蛋白特性（Perez-Martinez et al., 2009; Tavares-Carreón et al., 2008; Green-Willms et al., 2001; McMullin and Fox, 1993）。尽管这些调节因子在翻译水平发挥作用，但其功能后果体现在复合体IV的正确组装和稳定性上，从而直接影响整体ETC活性。总体而言，这些调节因子协调翻译控制以维持ETC的稳定性和活性。为评估这些翻译激活因子在ETC功能中的作用，我们在菌株C20中分别删除了编码基因，产生了突变菌株C21–C26。所有突变体均表现出角鲨烯滴度和生物量显著降低，证实完整的复合体IV生物发生对于维持ETC活性和支持高效角鲨烯生物合成是不可缺少的（图4B）。相反，我们在菌株C20中分别过表达了这些调节因子，产生了菌株C27–C32。其中，五个菌株（C27、C28、C29、C31和C32）表现出角鲨烯产量的显著增加，而C30菌株略有下降（1.6%），这可能是由于其作为辅助翻译因子的作用有限所致。

此外，在改良菌株中，C32实现了最高的角鲨烯滴度，为4.7 ± 0.1 g/L（图4C）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像 图4. 线粒体功能调控对Crabtree效应和角鲨烯生物合成的影响。（A）线粒体功能调节因子的作用示意图。（B）在C15菌株中HAP4过表达以及MSS51、PET309、PET111、PET54、PET122和PET494缺失对角鲨烯生产和生物量的影响。（C）在C20菌株中MSS51、PET309、PET111、PET54、PET122和PET494过表达对角鲨烯生产和生物量的影响。（D）在C20菌株中联合过表达MSS51、PET309、PET111、PET54、PET122和PET494对角鲨烯生产和生物量形成的影响。（E?G）菌株C20和C35在对数生长中期的胞内ATP含量（E）、NADPH/NADP+水平（F）和（G）乙醇积累量。"?"表示未进行遗传修饰。 随后，基于这些调节因子在线粒体mRNA翻译中的功能角色，采用模块化设计对其进行了联合过表达研究，由此获得了菌株C33至C38。其中，菌株C35（共表达Pet122和Pet494）表现出最高的性能，实现了4.8 ± 0.1 g/L的角鲨烯滴度，较C20提高了11.6%（图4D）。由于Pet122和Pet494是COX3特异性翻译激活因子，它们的共表达应有利于改善ETC（电子传递链）功能。为验证这一点，我们检测了胞内ATP水平和NADPH/NADP+比率，二者与ETC功能密切相关。与菌株C20相比，菌株C35在对数生长中期的胞内ATP水平提高了32.44%，NADPH/NADP+比率升高了4.62%（图4E和F），表明能量供应更加充足且代谢氧化还原状态适宜。菌株C35的最大乙醇积累量较C20减少了13.91%，表明发酵溢出减少，与Crabtree效应相关的表型得到部分缓解（图4G）。 此外，Δψm评估显示，菌株C35的Δψm显著高于其祖先菌株C20（0.94 ± 0.02）、C15（0.87 ± 0.07）和SquMC13（0.81 ± 0.07），甚至比CEN.PK2-1C（1.00 ± 0.04，归一化值）高出9.8%（图5A）。这些结果表明菌株C35的线粒体质量得到了显著改善。共聚焦荧光成像进一步证实，C35的线粒体荧光强度较C20增加了30.5%（图5B和表S5），印证了线粒体质量的改善。为进一步表征增强线粒体功能在不同营养条件下所伴随的生理变化，我们检测了菌株C15和C35在YPD培养基（图5C和D）和SC培养基（图S5A和B）中进行摇瓶培养期间的葡萄糖消耗、乙醇积累与再同化、生物量形成及角鲨烯产生的时间曲线。 下载：下载高分辨率图像（881KB）下载：下载全尺寸图像 图5. 线粒体翻译激活因子和电子转运相关因子对线粒体呼吸能力、Crabtree相关生理特征及角鲨烯生物合成的影响。（A）SquMC13、C15、C20、C35和CEN.PK2-1C的线粒体膜电位（ΔΨm）。（B）C20和C35的线粒体形态。线粒体用绿色荧光蛋白标记，通过共聚焦显微镜成像。比例尺=5 μm。（C、D）C15和C35菌株培养期间的葡萄糖消耗和乙醇积累/再同化（C）以及生物量形成和角鲨烯产生（D）的时间曲线。（E）SquMC13、C15、C20和C35菌株中线粒体呼吸链复合体IV活性。（F）SquMC13、C15、C20和C35菌株经OD600归一化后的耗氧率（OCR）。（G）C35菌株中呼吸相关基因CIT1、SDH2和COX4的相对表达水平。基因表达水平以亲本菌株SquMC13的值为基准进行归一化。基因表达采用以ACT1为内参基因的2?ΔΔCt法定量。误差棒表示三个生物学重复的标准偏差。（图例中对颜色的引用解释，请参阅本文的网页版。） 两种菌株在发酵早期显示出相似的葡萄糖消耗动力学，而C35积累的乙醇略少于C15。此外，尽管C35在培养后期的生物量较低，但其在大多数培养期间的角鲨烯产量均高于C15。这些结果表明，HAP4、PET122和PET494的共表达仅对Crabtree效应产生轻度影响，但显著改善了工程菌株的角鲨烯合成。与这些生理变化一致的是，与亲本菌株C15相比，C35菌株中线粒体呼吸链复合体IV活性显著增强，约为C15的4.71倍（图5E）。类似地，OCR分析显示，经OD600归一化后，C35菌株的OCR约为C15的5.37倍（图5F）。此外，对代表性呼吸相关基因的RT-qPCR分析显示，C35菌株中CIT1、SDH2和COX4的表达水平分别为SquMC13的1.10倍、2.46倍和3.81倍（图5G）。特别是SDH2和COX4的显著上调——二者均参与线粒体呼吸和电子转运——与C35菌株中观察到的复合体IV活性和OCR增强相一致。这些结果进一步支持PET122和PET494共表达增强了C35菌株的线粒体呼吸能力，并促进了更倾向于呼吸代谢的状态。 总之，这些发现表明PET122和PET494的共表达改善了线粒体功能，部分缓解了Crabtree效应引起的发酵溢出，从而增强了角鲨烯生物合成。 3.4 增强细胞对Crabtree效应所致代谢应激的耐受性 在工业高细胞密度培养条件下，Crabtree效应通常在酿酒酵母中引起过量的乙醇积累，主要通过乙醇诱导的氧化应激以及乙醇和葡萄糖相关的渗透应激对细胞生长和代谢产生毒性影响。这些类型的应激扰乱了中心代谢，损害了工程化酿酒酵母菌株在高葡萄糖环境中的稳健性，从而限制了其工业应用。因此，为评估细胞在Crabtree相关条件下的稳健性，所有后续分析均在升高的葡萄糖浓度（50和100 g/L）下进行。 为解决这一限制，减轻乙醇积累带来的代谢负担并增强菌株稳健性是间接缓解Crabtree效应不利影响的关键（Vemuri等，2007）。在这些应激因素中，乙醇诱导的氧化应激引起的氧化还原失衡是高葡萄糖条件下代谢负担的主要驱动因素（Condic等，2024）。鉴于氧化还原平衡和应激耐受性对辅因子可用性的关键依赖性，强化必需辅因子的生物合成为增强工程菌株的生产性能提供了一种有效策略（图6A）。硫胺素（维生素B1）是硫胺素二磷酸（ThDP）的前体，是糖酵解、TCA循环和氨基酸生物合成中的必需辅因子，在碳代谢和抗氧化应激防御中起着关键作用（Alff-Tuomala等，2016）。通过支持ThDP依赖性反应，硫胺素的增加可促进高效的碳通量重分配并缓解发酵条件下的NAD(P)H失衡。基于此原理，我们评估了强化硫胺素生物合成是否能在高葡萄糖条件下改善胞内氧化还原平衡和生产能力。 下载：下载高分辨率图像（947KB）下载：下载全尺寸图像 图6. 通过调控氧化还原应激和渗透耐受性获得的菌株性能表现。（A）硫胺素合成、HOG信号通路、乙醇产生、线粒体呼吸和细胞死亡之间相互连接的示意图。红色标记突出加速效应，绿色箭头突出减弱效应。（B）增强硫胺素合成途径菌株（THI4、THI5和THI4-THI5过表达）的角鲨烯滴度和生物量表现。（C）菌株C39、C40和C41的胞内活性氧（ROS）水平。（D）菌株C39、C40和C41的胞内NADPH/NADP+水平。（E）工程菌株C42、C43、C44和C45的角鲨烯滴度和生物量。（F）C42菌株中发酵基因PDC1和ADH1的相对表达水平。基因表达水平以亲本菌株SquMC13的值为基准进行归一化。基因表达采用以ACT1为内参基因的2?ΔΔCt法定量。误差棒表示三个生物学重复的标准偏差。（图例中对颜色的引用解释，请参阅本文的网页版。） 硫胺素的生物合成需要两种前体，即5-羟基乙基-4-甲基噻唑和羟基甲基嘧啶，分别由Thi4（硫胺素噻唑合酶）和Thi5（4-氨基-5-羟基甲基-2-甲基嘧啶磷酸合酶）合成（Wightman和Meacock，2003；Faou和Tropschug，2004）。已有研究表明，提高Thi4和Thi5的表达可以改善酿酒酵母的氧化还原平衡和细胞生长（Shi等，2016，2018）。据此，为检验增强硫胺素生物合成是否能改善胞内氧化还原平衡，我们在C35菌株中过表达了THI4和THI5，由此产生了C39（THI4过表达）和C40（THI5过表达）菌株。在高葡萄糖条件（50和100 g/L）下，C40菌株的角鲨烯滴度高于C35菌株。具体而言，在50 g/L葡萄糖条件下滴度增至5.4 ± 0.3 g/L（增加12.3%），在100 g/L葡萄糖条件下增至6.3 ± 0.5 g/L（增加40.0%），同时生物量积累也更高（分别增加23.3%和12.4%）（图6B）。与此同时，葡萄糖耗尽时的乙醇积累分别减少了12.90%和7.01%（图6B），表明与Crabtree效应相关的代谢应激得到部分缓解。这些结果表明，通过稳定胞内氧化还原稳态，强化硫胺素生物合成改善了代谢稳健性并减轻了高葡萄糖发酵条件相关的氧化应激。相比之下，THI4和THI5的共过表达（C41菌株）加剧了高葡萄糖条件下的代谢失衡。与C40相比，在50 g/L葡萄糖条件下角鲨烯滴度下降了18.5%，在100 g/L葡萄糖条件下下降了36.5%，同时生物量形成减少（分别减少17.1%和5.1%）（图6B）。与此同时，C40菌株的乙醇积累分别增加了11.88%和3.21%（图6B），这表明硫胺素合成途径的通量过高将氧化还原平衡与生产性代谢脱节，从而在ROS积累减少的情况下额外施加了代谢负担。与氧化还原状态的改变一致，工程菌株间的胞内ROS水平得到了显著调节。C40菌株的ROS含量较C35菌株减少了33.87%，这转化为改善的生长或生产性能（图6C）。C40菌株中硫胺素生物合成的强化改善了胞内氧化还原缓冲能力，证据是其在对数生长期中NADPH/NADP+比率较C35菌株增加了4.13%（图6D）。 除了氧化还原应激外，高葡萄糖可用性和乙醇积累引起的渗透和乙醇应激是Crabtree条件下菌株稳健性的另一个主要挑战。转录因子SPT15编码TATA结合蛋白，能增强酵母对乙醇和其他应激的耐受性（Kim等，2013；Li等，2018）。在C40背景下过表达SPT15（C42菌株）在50和100 g/L葡萄糖条件下分别产生了6.3 ± 0.3 g/L和6.5 ± 0.3 g/L的角鲨烯滴度，与C40菌株相比分别增加了16.7%和3.2%（图6E）。SPT15过表达的有益效应可能源于其对参与应激适应的转录程序的全局调控，包括但不限于高渗透性甘油（HOG）通路，其中HOG1在赋予乙醇和渗透应激耐受性中发挥核心作用（Kim等，2013）。然而，在C40背景下直接过表达HOG1（C43菌株）未能带来进一步改善；相反，在100 g/L葡萄糖条件下，C43的角鲨烯滴度较C40下降了3.7%（图6E）。这一下降可能归因于对复杂且精密调控的HOG1调控网络的无意干扰，这可能造成了系统性代谢失衡。 鉴于其在碳代谢重编程、应激适应和离子平衡方面被报道的作用，多效性转录调节因子Cat8（C6锌簇转录激活因子）和Usv1（应激下碳代谢和离子平衡调节因子）在C40背景下进行了进一步评估，由此产生了C44和C45菌株（Costa等，2023；Deng等，2023）。与C40菌株相比，这两种菌株均未改善角鲨烯产量；相反，它们的角鲨烯滴度显著下降。具体而言，在100 g/L葡萄糖条件下，C44和C45的角鲨烯滴度分别下降了3.7%和14.8%（图6E）。这一下降可能归因于Cat8激活糖异生与高葡萄糖条件下角鲨烯合成所需的强烈糖酵解活性之间的代谢通量竞争。对于Usv1，更显著的下降可能反映了其对碳代谢和离子稳态的更广泛影响，这在发酵条件下可能额外施加了代谢负担。

RT-qPCR分析进一步表明，菌株C42中发酵基因PDC1和ADH1的表达水平分别上调至SquMC13的2.50倍和2.87倍（图6F）。这些结果表明，菌株C42在高葡萄糖条件下维持了活跃的发酵代谢，同时表现出更强的细胞耐受性和代谢鲁棒性。总体而言，这些结果表明，通过增强硫胺素介导的氧化还原缓冲能力，并结合过表达SPT15以提高对渗透压和乙醇胁迫的耐受性，有助于缓解高葡萄糖条件下与Crabtree效应相关的发酵胁迫所致的生理负担。

3.5 50 L生物反应器中的流加补料发酵生产角鲨烯

为评估该工程菌中减弱Crabtree效应的应用潜力，分别通过补充转录调节因子GAL80及营养缺陷标记基因LEU2、URA3、HIS3和TRP1，将菌株C42和SquMC13构建为菌株C47和SquMC14。随后在50 L搅拌式生物反应器中，使用YPD培养基对菌株C47和亲本菌株SquMC14进行流加补料发酵并进行比较。由于角鲨烯生物合成途径中所有人工表达的基因均由半乳糖诱导系统调控，因此采用了两阶段发酵策略，将细胞生长与角鲨烯生产解耦联，从而通过葡萄糖补料实现高效的细胞高密度培养。

由于Crabtree效应的影响，初始葡萄糖补料阶段乙醇的积累必须严格控制。具体而言，应将葡萄糖代谢产生的乙醇浓度维持在发酵液中10 g/L以下，以避免显著的生长抑制。当培养物OD600达到约140时，通过添加半乳糖至终浓度为7 g/L启动第二阶段（即角鲨烯生产）。在此条件下，菌株C47在50 L生物反应器中实现了57.2 g/L的角鲨烯滴度，生产强度为0.47 g/L/h，与菌株SquMC14相比分别提高了2.44倍和1.96倍（图7A和B）。基于流加补料发酵过程中的总葡萄糖消耗量，工程菌株C47实现了0.082 g/g葡萄糖的整体角鲨烯产率。

图7. 50 L搅拌式发酵器中菌株SquMC14（A和C）和C47（B和D）的流加补料发酵性能。误差线表示标准差（n=3）。

为评估菌株C47在发酵过程中Crabtree效应是否减弱，通过在线尾气分析在50 L发酵器中测量了菌株C47和SquMC14的耗氧速率（OUR）、二氧化碳释放率（CER）和呼吸商（RQ）。与SquMC14相比，C47在角鲨烯生产阶段表现出更高且更稳定的OUR和CER值，表明其呼吸代谢活性、能量代谢强度和代谢稳定性显著增强。值得注意的是，SquMC14的RQ（约1.3）在整个发酵过程中始终在1.0以上大幅波动，而C47的RQ从初始的高值下降至约1.0并随后保持稳定（图7C和D）。这表明C47具有比SquMC14显著更强的呼吸代谢能力，而在SquMC14中，角鲨烯生产期间仍存在显著的发酵代谢。

为进一步在定义营养条件下评估C47，在SC培养基中进行了50 L流加补料发酵。乙醇积累控制在约5 g/L，生物量和角鲨烯滴度分别达到OD600约160和约22.1 g/L（图S6A）。在早期发酵阶段之后，RQ稳定在接近1.0的水平，OUR和CER曲线呈协调变化（图S6B），表明C47减弱的Crabtree表型在SC条件下得以保留。

这种增强的呼吸代谢能力有效减少了葡萄糖补料阶段的乙醇溢流，将乙醇浓度维持在所需范围内（<10 g/L）。因此，这也支持了C47中的稳健细胞高密度培养和持续的角鲨烯生物合成。这些发现证实了菌株C47中减弱的Crabtree效应，并展示了缓解该效应在提高工程酿酒酵母菌株细胞高密度培养性能方面的优势，从而增强了其生产角鲨烯及其他萜类化合物的能力。

综上所述，这些结果表明，通过整合调控能量感知、全局转录、线粒体功能和胁迫耐受性来缓解Crabtree效应，可显著提升酿酒酵母的角鲨烯产量。所达到的57.2 g/L滴度也代表了角鲨烯生产的新纪录。

4. 结论

本研究建立了一个代谢工程框架，以缓解酿酒酵母中的Crabtree效应并显著提高角鲨烯产量。通过对SNF1/AMPK通路、转录/代谢调节因子、线粒体呼吸能力和细胞胁迫耐受性的逐步调控，我们开发了菌株C47，该菌株在50 L流加补料生物反应器中实现了57.2 g/L的创纪录角鲨烯滴度。与乙醇溢流减少相对应，在线尾气分析显示RQ从约1.3（亲本菌株SquMC13）降至约1.0（C47），支持了溢流代谢的缓解和呼吸代谢的增强。本工作验证了缓解Crabtree效应作为释放酵母生物合成潜能的策略的有效性，为角鲨烯的工业生产奠定了基础，并建立了一个可持续合成高价值萜类化合物和非乙醇代谢产物的有前景的平台。

CRediT作者贡献声明

Shuyan Tang：撰写—初稿、可视化、验证、方法论、调查研究、形式化分析、概念化。Wenzhuo Gao：验证、形式化分析。Jiaying Wang：方法论、数据管理。Dongzhi Wei：撰写—审阅与编辑、监督、资源。Feng-Qing Wang：撰写—审阅与编辑、监督、资源、经费获取。

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