《Nucleic Acids Research》：Structures and dynamics of the major G-quadruplex in the human PDGFR-β gene promoter: insights into vacancy G-quadruplex formation
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摘要翻译：PDGFR-β（血小板衍生生长因子受体β）激酶的过度表达与多种人类疾病相关，包括癌症、心血管疾病和纤维化。在PDGFR-β启动子中形成的G-四链体（G4s）作为转录抑制因子，是有吸引力的治疗靶点。研究人员先前报道，PDGFR-β启动子的主要G4形成区
摘要翻译：PDGFR-β（血小板衍生生长因子受体β）激酶的过度表达与多种人类疾病相关，包括癌症、心血管疾病和纤维化。在PDGFR-β启动子中形成的G-四链体（G4s）作为转录抑制因子，是有吸引力的治疗靶点。研究人员先前报道，PDGFR-β启动子的主要G4形成区域采用独特的断裂链G4结构，而该序列的截短则产生空缺G4（vG4），空缺G4可被外源鸟嘌呤类似物或代谢物填充，并进一步被小分子稳定，提示了潜在的调控机制和选择性药物靶向的机会。然而，断裂链G4与vG4之间的关系仍不清楚。在此，研究人员证明PDGFR-β启动子序列在两种断裂链G4构象之间形成动态平衡，这两种构象在毫秒时间尺度上相互转换，vG4作为中间体。研究人员解析了这些相互转换G4的高分辨率NMR结构，它们共享保守的vG4核心，但在分子内鸟嘌呤“填充”方面有所不同。两种构象均具有PDGFR-β启动子特有的稳定G–G封端碱基对。这些发现阐明了断裂链PDGFR-β启动子G4的结构细节以及vG4形成的机制，为选择性药物靶向提供了关键见解，并为合理设计小分子调控PDGFR-β转录建立了框架。
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研究背景与问题：G-四链体（G4）是由富含鸟嘌呤的核酸序列形成的四链二级结构，在癌基因启动子中富集并参与转录调控。PDGFR-β（血小板衍生生长因子受体β）是一种受体酪氨酸激酶，其过度表达与多种癌症、心血管疾病和纤维化相关。PDGFR-β基因近端启动子含有一个GC富集的核酸酶超敏元件（NHE），能形成G4并抑制转录，小分子稳定该G4可沉默PDGFR-β表达，因此是转录调控的潜在靶点。该区域的主要G4形成序列包含四个G-run（II–V），分别含7、2、4、3个鸟嘌呤。研究人员此前发现，使用Pu22序列（含G-run II、III、IV和V部分）时，该G4采用三层层平行结构，但具有独特的断裂链基序：结构中并未使用G-run II、IV、V的连续三鸟嘌呤轨道，而是纳入G-run III的2个鸟嘌呤（G11、G12），并由G-run V的3′末端G22补全形成断裂G链。这种折叠最大化1-nt链反转环的数量（三个）。进一步研究发现，截短填充G-run V可形成空缺G4（vG4），其具有不完整的G-四分体，可被外源鸟嘌呤衍生物（如cGMP或GTP）填充，并被小分子靶向稳定。然而，在更长的启动子序列中，G22的分子内填充似乎阻碍了vG4的形成，因此延伸PDGFR-β启动子中vG4能否形成以及如何形成尚不清楚。
研究内容与结论：研究人员使用延伸的Pu24序列（在Pu22的3′端增加两个腺苷残基）模拟天然启动子环境中非末端G22的上下文。通过一维1H NMR、二维NOESY、ROESY、HSQC等核酸磁共振技术，发现Pu24在K+溶液中以两种断裂链G4构象的动态平衡存在：一种由G22填充（对应Pu22结构），另一种由G21填充（对应Pu21结构）。两种构象在毫秒时间尺度上相互转换，vG4作为转换中间体。研究人员解析了Pu22（PDB ID: 9P9X）和Pu21（PDB ID: 9P9Y）的高分辨率NMR结构，两者均为三层平行断裂链G4，共享相同的vG4核心，但3′端填充鸟嘌呤不同（G22或G21），并通过不同的回折（snap-back）环递送。两种结构都包含一个独特的反向Hoogsteen G:G封端碱基对（G17:G21或G17:G20），该碱基对堆叠在3′端G-四分体上，对稳定断裂链结构至关重要。突变该碱基对中的鸟嘌呤会显著降低热稳定性。NMR交换谱分析表明，Pu24中G22填充型为主要构象（约75%），G21填充型为次要构象（约25%），交换速率kex为2.1 s?1，对应约500 ms的时间尺度。此外，只有具有至少两个3′侧翼残基的延伸序列（如Pu24、Pu25）才能发生构象互变并允许外源dGMP填充，而截短的Pu21、Pu22、Pu23（单侧翼残基）不能与dGMP竞争。这表明延伸序列中分子内填充鸟嘌呤变得动态化，可瞬时脱离形成vG4开放态，该开放态可被外源鸟嘌呤衍生物填充，进而被小分子靶向。
关键技术方法：本研究主要运用了高分辨率核磁共振（NMR）波谱学方法，包括一维1H NMR、二维NOESY（核欧弗豪森效应谱）、ROESY（旋转坐标系欧弗豪森效应谱）和1H-13C HSQC（异核单量子相干谱），用于解析结构、归属共振信号和检测交换峰。采用Xplor-NIH和Amber程序进行基于NOE距离约束的分子动力学结构计算。圆二色（CD）光谱用于表征G4拓扑构型并测定熔解温度。此外，结合了此前发表的DMS足迹实验数据验证填充鸟嘌呤的保护状态。NMR样品为100 mM K+溶液，pH 7，温度范围5°C–40°C。
研究结果分述：
1. 延伸的PDGFR-β启动子G4形成序列形成两种平衡的断裂链结构Pu22和Pu21：通过比较Pu24与Pu22、Pu21的一维NMR谱图，发现Pu24中存在两组G9亚氨基峰，一组与Pu22一致（主要），另一组与Pu21一致（次要），表明Pu24中两种构象共存。Pu20不能形成明确定义的G4，支持G21参与填充。
2. Pu22和Pu21形成三层平行断裂链G4：通过2D NMR完全归属质子共振，定义出5′端四分体（G3-G7-G11-G14）和中心四分体（G4-G8-G12-G15），以及3′端四分体（G5-G9-G22/G21填充-G16）。连续链的NOE和CD特征证实了平行拓扑和三个1-nt链反转环。
3. G22或G21通过不同回折环进行3′端填充并具有保守G:G封端：填充鸟嘌呤通过5-nt（Pu22）或4-nt（Pu21）回折环递送。非四分体G17的亚氨基质子化学位移偏下，表明形成NH—N氢键，与相邻的G21或G20形成反向Hoogsteen G:G碱基对。Pu22中G20为syn构象，Pu21中A19为anti构象，导致3′四分体化学位移不同。
4. PDGFR-β Pu22和Pu21 G4的高分辨率NMR结构：最终结构集合整体RMSD分别为0.71 ?（Pu22）和0.61 ?（Pu21）。填充鸟嘌呤均为anti构象，不同于其他断裂链G4常见的syn填充。回折环中的G:G碱基对起稳定作用，突变实验证实其重要性。5′端A1和A2以头对头方式堆叠在5′四分体上。
5. G22填充型和G21填充型G4在延伸PDGFR-β启动子中于毫秒时间尺度互变：利用NOESY和ROESY实验区分NOE峰与交换峰，归属了Pu24中次要构象的化学位移。通过变混合时间NOESY测定A23H8交换峰增长，确定kex约为2.1 s?1。交换峰涉及G17至G22区域，表明互变仅涉及3′回折环的重新排列，vG4核心保持完整。
6. 延伸的PDGFR-β启动子序列可形成vG4并被外源dGMP填充：Pu21、Pu22、Pu23不能与dGMP发生填充，而Pu24、Pu25可被dGMP填充并出现新峰。Pu24的Tm（69°C）显著低于Pu22/Pu21（80°C），表明动态互变降低了整体稳定性，开放态vG4允许外源鸟嘌呤进入。
讨论总结：研究揭示了断裂链G4在延伸启动子中通过vG4中间体进行分子内填充鸟嘌呤交换的机制。这一机制具有序列内在性，并与细胞中GTP浓度升高的环境相关。细胞内鸟嘌呤代谢物（微摩尔亲和力）可稳定vG4构象，将平衡向该状态移动。当GTP浓度在增殖癌细胞中升高时，可能促进vG4的形成和稳定，为选择性药物干预提供了可能性。vG4开放态可被外源鸟嘌呤衍生物填充并进一步被小分子靶向，这为针对PDGFR-β转录调控的合理药物设计提供了结构基础。
研究结论：本研究表明，PDGFR-β启动子vG4是选择性药物干预和转录调控的有前景靶点。在延伸启动子中，断裂链G4的分子内填充鸟嘌呤变得动态化，瞬时脱离形成vG4中间体。该开放态可被替代性分子内鸟嘌呤或外源鸟嘌呤衍生物填充。研究解析了两种填充型G4的高分辨率NMR结构，两者共享相同的vG4核心，由独特的反向Hoogsteen G:G封端碱基对稳定。两种构象在毫秒时间尺度上通过vG4相互转换，无需整体重折叠。该工作确立了PDGFR-β vG4的结构基础，为靶向异常PDGFR-β表达相关疾病的治疗干预提供了新途径。
