上转换纳米颗粒介导的RAW 264.7巨噬细胞内单线态氧生成

《ACS Omega》：Intracellular Singlet Oxygen Generation Mediated by Upconversion Nanoparticles in RAW 264.7 Macrophages

　　

能够在近红外（NIR）激发下产生活性氧的上转换纳米颗粒（UCNPs）已成为生物医学应用（尤其是光动力疗法（PDT）和免疫相关调控）中有前景的平台。研究人员探究了功能化有光敏剂的核壳结构UCNPs在细胞内生成单线态氧（1O2）的生物应用。该纳米颗粒表现出可重复的形貌、相纯度和强上转换发射强度，可在NIR激发下高效激活。研究人员采用小鼠RAW 264.7巨噬细胞作为天然免疫细胞模型，评估纳米颗粒摄取、细胞相容性及光触发1O2产生。基于发光的检测与显微镜分析证实，在低能量NIR激发下发生高效细胞内在化与局部1O2生成；细胞毒性研究显示无辐照时基础毒性低。光激活后细胞活力显著下降，与光动力诱导的氧化应激一致。这些结果进一步表明，基于UCNP的纳米平台可作为吞噬性免疫细胞内活性氧的有效胞内发生器，并凸显其在PDT、氧化还原调控及细胞膜水平分子互作研究中的潜力。

研究背景与立项依据

巨噬细胞是天然免疫系统的核心，也是最早接触外来材料（包括工程化纳米材料）的细胞类型之一。小鼠RAW 264.7巨噬细胞因高吞噬活性与培养稳定性，被广泛用作纳米材料—免疫细胞互作研究的体外模型。镧系掺杂上转换纳米颗粒（UCNPs，以NaREF₄为基质，掺Er³⁺/Tm³⁺/Yb³⁺）可将980 nm近红外（NIR）光转换为可见光/红外的多光子发射，具备深组织穿透、抗光漂白与低自发荧光背景优势；将其与光敏剂偶联，可克服传统光敏剂可见光穿透不足的限制，实现NIR触发的原位单线态氧（¹O₂）生成。然而，现有研究多依赖化学探针或荧光报告间接证明¹O₂生成，在复杂细胞环境中直接检测¹O₂特征1270 nm磷光的研究稀少；同时，免疫细胞内UCNPs的摄取路径、胞内定位与光动力响应关系仍待阐明。为此，研究人员在《ACS Omega》报道了核壳NaErF₄:Tm³⁺@NaYF₄ UCNPs经聚马来酸酐-alt-1-十八烯（PMAO）修饰并共价偶联甲苯胺蓝O（TBO）的纳米平台，在RAW 264.7巨噬细胞中评估摄取、暗态毒性及980 nm激光触发胞内¹O₂直接生成。

主要关键技术方法

研究人员制备两种尺寸（UCNP I、UCNP II）的β-NaErF₄:Tm³⁺@β-NaYF₄核壳UCNPs，以PMAO包覆（约1聚合物/nm²），通过酸酐-胺酰胺键偶联TBO（TBO占胺位0.5%，余99.5%接PEG以降低暗毒）。细胞实验采用商业来源RAW 264.7巨噬细胞系，设100 μg/mL纳米颗粒浓度、两种TBO密度（酸酐/胺=1:100与1:10）。表征技术含透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、X射线衍射（XRD）、980 nm激发光致发光谱；胞内摄取用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、TEM超薄切片、4 °C vs 37 °C吞噬抑制实验；毒性用台盼蓝排斥法（暗态30 min–24 h，光态980 nm 800 mW 60 s）；¹O₂直接检测用细胞悬液石英比色皿中980 nm 800 mW辐照30 s采集1270 nm磷光。

研究结果

3.1 纳米材料表征

TEM显示UCNP I核径10.15±0.48 nm，壳层生长后17.75±1.69 nm，形貌均一六方相；DLS水动力学直径递增印证包覆与偶联。光致发光谱中Er³⁺ 658 nm红带与TBO水相吸收（500–700 nm）重叠；偶联TBO后658 nm发射淬灭，UV-Vis出现550–700 nm宽带，证实UCNP→TBO共振能量转移可行。

3.2 RAW 264.7巨噬细胞内化与定位

CLSM显示TBO（AF610通道）信号2 h即可见，8–10 h胞质周核区累积，不与DAPI核染共位；TEM见电子致密纳米结构位于吞噬泡样囊泡，且UCNP组细胞膜伪足增多。4 °C孵育2 h无TBO信号、37 °C有明确胞内信号，证伪能量非依赖途径，支持以吞噬作用为主（巨胞饮等不能排除）的摄取机制。

3.3 暗态细胞毒性

100 μg/mL下UCNP I/II及两种TBO密度处理30 min–24 h，台盼蓝存活率与细胞对照无统计差异（p>0.05），表明无辐照时平台基础毒性低。

3.4 单线态氧生成

细胞孵育12 h、洗涤离心后重悬于PBS，980 nm 800 mW辐照30 s（0.8 W/cm²，24 J/cm²），在1270 nm处Group I-1与II-1均检出高于激光空白与细胞对照的¹O₂磷光，为复杂细胞基质中直接观测胞内¹O₂提供证据，说明摄取后光敏剂仍功能连接且上转换-能量转移链完整。

3.5 980 nm激光光毒性

60 s辐照后，无颗粒激光对照存活率降约15%（光热/光物理应激），非功能化UCNP组相近；而UCNP@PMAO@TBO组存活率降至约50%（酸酐/胺1:10）或70–80%下降（1:100），结合1270 nm直接检出的¹O₂，判定光动力ROS主导杀伤。

讨论与结论翻译

讨论指出，尽管UCNPs在PDT中进展显著，免疫细胞内纳米架构—表面功能—胞内转运—光动力应答的关系仍需深化；本研究以直接1270 nm磷光（非间接探针）证实吞噬细胞内NIR触发¹O₂原位生成，弥补了该证据缺口。结论部分表明：在含胞内UCNPs的细胞悬液中检出1270 nm ¹O₂磷光，证实材料在低浓度下仍具功能；UCNP发射被TBO吸收并向分子氧转移能量，无需外加氧源；暗态低毒、光激活显著致死，验证其作为胞内ROS发生器潜力；CLSM与TEM共证吞噬进入、非核定位，可为表面重设计靶向其他细胞器提供基础；该NIR窗口深穿透、NaREF₄光稳定、上转换荧光低噪的特性，支持其在氧化还原生物学、PDT与复杂系统成像中的拓展应用。