综述：NMR揭示生物分子凝聚体在其双相状态下的性质

《Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy》：NMR reveals the properties of biomolecular condensates in their biphasic state

　　

•通过扩散和弛豫对比对双相凝聚体进行无标记核磁共振（NMR）研究。
•REDIFINE量化扩散系数、分配系数、液滴尺寸和交换。
•多重过滤（Multiplexing filter）可选择性地观察单个凝聚体组分。
•CONDENSE-MT基于水检测NMR不可见半固态凝聚体的动力学。

【1. 引言】
液-液相分离（LLPS）是生物分子凝聚体形成的基础，这些无膜细胞器动态组织细胞内生化过程。核磁共振（NMR）波谱对分子运动和相互作用敏感，已用于表征凝聚体的内部动力学、交换过程和瞬时结构序。早期研究多采用沉淀或离心制备宏观致密相，虽能提供致密相物理性质，但缺少液滴-稀相界面。界面对于分子交换、表面调控成熟和多相结构至关重要。在NMR测量中维持双相样品面临沉降、聚结和贴壁等问题。低浓度琼脂糖水凝胶可稳定液滴，保持其形貌和物理性质，同时不显著影响分子扩散。基于此，扩散过滤和弛豫对比方法得以发展，如LLPS REDIFINE利用受限扩散和交换量化凝聚体参数，CONDENSE-MT利用半固态磁化传递检测不可见凝聚体。多重过滤扩展至多组分系统。本综述总结这些方法。

【2. 保持两相共存的重要性】
生物分子凝聚体由共存的致密相和稀相组成，界面调控分子交换、液滴稳定性和物质性质随时间演化。界面张力调节凝聚体的粘弹性、融合和形变能力。宏观致密相样品因缺乏界面而不同于生理相关凝聚体。凝聚体成熟常始于界面，密度和浓度梯度可能促进成核事件，病理性聚集也认为与界面相关。维持双相平衡更接近细胞内环境，可研究配体分配、拥挤剂调节和翻译后修饰等。低百分比琼脂糖基质提供机械支撑的多孔支架，防止液滴沉降、聚结和贴壁，不干扰平衡性质，延长测量时间，且不显著限制分子扩散，因此成为双相NMR方法的关键工具。

【3. 利用扩散和MT对比研究双相状态下的凝聚体】
NMR扩散实验通过磁场梯度衰减信号测量平动扩散。脉冲梯度自旋回波（PGSE）和脉冲梯度受激回波（PGSTE）是常用方法。信号衰减符合I/I₀ = e^?bD，其中b = γ²g²δ²Δ。稀相蛋白质扩散系数约10^?11–10^?10 m²/s，而凝聚相中极慢（约10^?13 m²/s），常规探头（最大约50 G/cm）无法分辨，表现为“不可见”。当两相信号重叠时，观测到的衰减曲线受化学交换影响，呈现非单指数行为，可用扩散峰度（kurtosis）表示。不同凝聚体的峰度因子K和表观扩散系数随扩散时间变化，反映受限扩散和交换。需要更复杂的模型来解码信息。

【3.1 界面交换下的受限扩散概念】
Callaghan等人早期在孔隙介质中观察到扩散衍射效应，可用于测量孔径。在生物凝聚体中，界面张力限制液滴内扩散，分子可“弹回”或交换至稀相。LLPS REDIFINE方法利用球形液滴的平均半径R_drop和内在扩散系数D_cond描述受限扩散，表观扩散系数还依赖于扩散时间Δ和梯度参数q。界面渗透率p描述跨边界交换，化学交换速率常数k_cd = 3p/R_drop，依赖于表面积与体积比。

【3.2 REDIFINE模型】
REDIFINE模型考虑凝聚相（ν_cond）和稀相（ν_dil）两个交换池，假设稀相为各向同性扩散（D_dil），用McConnell微分方程描述磁化演化。总信号是两相贡献之和。模拟显示：液滴尺寸越小，表观扩散系数越慢；界面渗透率增加使两相扩散信息混合；各相群体影响衰减曲线形状。通过全局拟合5个参数（D_dil、D_cond、ν_cond、R_drop、p）可提取凝聚体性质。对FUS蛋白N端结构域（FUS NTD）、全长FUS以及SARS-CoV-2核衣壳蛋白（Nucleocapsid，Nu）凝聚体的实验验证表明，REDIFINE还能利用水信号和RNA信号进行多组分分析，无需标记。

【3.3 高度重叠信号的多组分凝聚体多重分析】
多数生物学凝聚体是多组分的，含多个内在无序区（IDR），其谱峰严重重叠。扩散过滤可选择性观测慢扩散的凝聚相信号，但分离稀相较难。由于凝聚相中交叉弛豫和核Overhauser效应（NOE）增强，磁化传递（MT）在凝聚相更高效，可通过选择性饱和凝聚相信号来保留稀相信号。该MT过滤与扩散过滤结合，可在FUS NTD和全长FUS样品中有效分离两相。进一步与同位素过滤/编辑结合（利用¹⁵N和¹³C标记），可同时分辨多组分凝聚体中不同蛋白的四种状态，即便其谱峰完全重叠。多重过滤还可扩展REDIFINE至多组分和细胞环境。

【3.4 未来潜力与局限】
REDIFINE提供无标记、通用的NMR框架，可量化相特异性扩散系数、分配、界面渗透性和液滴尺寸。未来可扩展至代谢物、离子等，纳入液滴尺寸分布、非球形几何和复杂环境。主要局限是快速化学交换（>30 s^?1）导致扩散衰减交换平均化，无法提取液滴参数；质子交换要求使用非交换共振；群体高度不对称降低敏感性；需要信号保持可观测。多重过滤存在类似限制，强谱线展宽或信号丢失会限制分析。

【4. 利用弛豫对比】
许多凝聚体中的结构域或结构化RNA信号因弛豫增强而完全不可观测，例如SARS-CoV-2核衣壳蛋白和CAG重复RNA。此时水是唯一可检测信号，可利用质子交换和弛豫对比间接检测无信号凝聚体。水检测的化学交换饱和转移（CEST）在不可见RNA凝聚体上显示出宽达±40 kHz的饱和转移效应，不能用常规CEST描述，而需采用MRI中的半固态磁化传递（MT）形式。据此发展出CONDENSE-MT方法。

【4.1 通过CONDENSE-MT表征半固态凝聚体】
CONDENSE-MT采用水检测的饱和转移实验，定量描述半固态凝聚体对水的MT效应。由于琼脂糖本身也有MT背景，需建立水与两个半固态池（琼脂糖和凝聚体）之间的三态交换模型，并多步拟合。该模型可拟合出交换速率、半固态T₂等参数。模拟表明，CONDENSE-MT对T₂小于30 μs的物质敏感，可检测低于0.1%的¹H群体，并可量化凝聚体水合状态。通过水弛豫率随凝聚体群体的变化，结合Bloembergen-Purcell-Pound理论，可估计凝聚体水分子的转动相关时间。对(5'-CAG-3')₃₁ RNA凝聚体，估算出每个凝聚体RNA质子对应约26个多余水质子，水转动相关时间约3.6 ns，显著慢于自由水。

【4.2 CONDENSE-MT的应用：CAG重复扩增RNA凝聚体】
CONDENSE-MT被用于完全NMR不可见的CAG重复RNA凝聚体表征。MT效应随RNA浓度增加，量化得到凝聚RNA群体P_condensate增加，表观水R₂升高，而凝聚体内部动力学（T_2,condensate）基本不变。存在约25 μM的下临界浓度。Mg²⁺调节RNA进入凝聚体的分配，但不改变凝聚体内部动力学和相对水含量。更重要的是，延长CAG重复长度（从10到44个重复）导致相同凝聚体群体下表观水R₂下降，表明更长的致病性RNA凝聚体含水量更低，从约42个水质子/RNA质子降至22个，可能解释了CAG重复超过阈值才形成病理灶的原因。

【4.3 未来潜力与局限】
CONDENSE-MT是溶剂检测策略，无需同位素标记、低温探头或高磁场，信号放大2–3个数量级，可检测浓度低至10 μM的凝聚RNA。即使凝聚相完全不可观测或没有生物分子物理交换也适用。局限在于提供集成信息，无法区分分子或残基；琼脂糖等基质产生竞争MT效应；慢质子交换或弛豫对比不足会限制应用