功能性酵母表面展示FLS2的方法开发与限制因素鉴定

《ACS Synthetic Biology》：Development of Approaches and Identifying Limitations toward Functional Yeast Surface Display of FLS2

　　

模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）如鞭毛蛋白感知2（FLAGELLIN SENSING 2, FLS2）是植物免疫的核心，也是工程化改造以拓宽对细菌性植物病原体检测的吸引人靶标，应用于粮食作物的病虫害防治（和诊断）及可持续农业实践。然而，直接在植物中评估大量FLS2变体对病原体感知特异性的改变是缓慢且低通量的，并且很少针对异源展示系统进行优化。在此，研究人员建立了使拟南芥（Arabidopsis thaliana）FLS2胞外域在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表面表达的条件，并评估了其与同源配体flg22的结合。研究人员展示了在标准酵母表面展示条件下，酵母对FLS2胞外域的高甘露糖糖基化如何导致折叠效率低下并丧失可检测的flg22结合。所有N-糖基化基序的取代都损害了表面表达，表明一定程度的糖基化是运输所必需的。研究人员使用衣霉素（tunicamycin，一种N-连接糖基化抑制剂）并结合热应激来调节内质网质量控制，从而调整糖基化程度。在这些条件下，研究人员观察到尽管总体表达降低，但仍存在一个可重复的细胞亚群，其flg22结合得到改善，并通过流式细胞术和磁性微珠富集证实了flg22对非FLS2蛋白的选择性。在FLS2胞外域高甘露糖聚糖结构建模的指导下，研究人员将选定N-聚糖位点的天冬酰胺替换为丝氨酸。研究人员鉴定出一个关键的聚糖位点变体N388S，该位点靠近flg22结合界面，并在应激条件下增加了结合群体大小。针对FLS2变体和已报道的非结合变体的结合测定证实，FLS2选择性是FLS2展示所特有的，表明所有变体均与flg22保持低亲和力相互作用。总之，这些结果表明FLS2展示条件（不仅仅是糖基化状态）是检测真实flg22相互作用的潜在限制，需要更灵敏的方法来可靠地分辨真正的结合群体。

**研究背景与存在问题**
全球气候变化和病原体快速进化威胁可持续农业，导致主要作物病害压力增加。例如，由细菌性病原体候选韧皮部杆菌亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）引起的柑橘黄龙病，自2000年代中期以来使佛罗里达柑橘产量下降约90%。植物对细菌性病原体的防御反应效率取决于宿主对鞭毛蛋白病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）的识别敏感性。模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）鞭毛蛋白感知2（FLAGELLIN SENSING 2, FLS2）作为关键细胞门控，识别细菌鞭毛蛋白保守表位flg22，通过共受体BAK1启动模式触发免疫。FLS2-flg22识别具有共同进化特征：flg22序列的单氨基酸变化可消除特定FLS2变体的感知，而FLS2直系同源物中的补偿突变可恢复或拓宽对未识别肽段的响应。这种可调性使FLS2成为拓展可检测细菌病原体谱系的蛋白工程强大候选。然而，在植物中高通量工程改造FLS2变体仍具挑战性，即使有CRISPR-Cas和纳米颗粒递送进展，生成和表型分析转基因植物通常只能支持10²?10³变体库且需数月。异源宿主如细菌、昆虫或哺乳动物细胞常缺乏植物样糖基化，或未针对大规模表面展示优化。酵母（酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和毕赤酵母Pichia pastoris）具有真核、遗传可操作、支持酵母表面展示平台可常规筛选>10⁷变体的优势。但FLS2是异常大且高度糖基化的受体，先前尝试在酵母表面展示其胞外域未能产生可检测的配体结合。未优化的结合条件以及内质网质量控制（endoplasmic reticulum quality control, ERQC）和N-连接糖基化方面的植物-酵母折叠差异，可能使功能表达复杂化。因此，研究人员着手解决先前缺陷，建立功能性FLS2胞外域展示系统。

**研究内容与意义**
研究人员系统研究了酵母N-连接糖基化和内质网应激如何影响拟南芥（Arabidopsis thaliana）FLS2胞外域的表面展示和配体结合。研究表明，酵母表面表达的FLS2被高甘露糖聚糖广泛修饰；完全去除N-糖基化基序损害运输；部分抑制糖基化结合热应激可产生弱但可检测的flg22阳性展示表型。通过结构建模，确定N388聚糖位点靠近flg22结合界面，对flg22阳性表型特别不利。这些结果为研究富集兼容的flg22结合表型提供建议，以实现FLS2功能性酵母表面展示。该研究发表于《ACS Synthetic Biology》，为FLS2及其他难表达植物糖蛋白的酵母表面展示明确关键障碍和条件，为高通量植物免疫受体工程奠定基础。

**主要关键技术方法**
研究人员采用的主要方法包括：基于Aga2融合的酵母表面展示系统，在酿酒酵母EBY100菌株中表达拟南芥FLS2胞外域（FLS2LRR）；流式细胞术检测表面表达与flg22-TAMRA结合；Western blot结合Endo H处理分析糖基化状态；衣霉素抑制N-连接糖基化，结合37 °C热应激调节内质网应激；AlphaFold2 Multimer建模与Rosetta稳定性计算指导天冬酰胺→丝氨酸取代；GlycoShape Re-glyco工具将酵母高甘露糖聚糖建模到FLS2晶体结构（PDB ID 4MN8），选择候选聚糖位点；磁性微珠（链霉亲和素包被）结合生物素-flg22进行细胞富集。样本来源为酿酒酵母EBY100菌株及拟南芥FLS2胞外域序列。

**研究结果**
**FLS2在标准酵母展示条件下表面展示但缺乏可检测的flg22结合**：研究人员将FLS2胞外域以Aga2融合形式展示于酵母表面（FLS2LRR）。流式细胞术显示>50%细胞表达阳性，Western blot确认融合蛋白产生，但标准条件下未观察到flg22结合，表明存在表面表达与配体结合的解偶联。

**去除所有预测的N-糖基化基序减少FLS2表面展示并增加胞内滞留**：通过计算分析，将22个预测N-糖基化位点的天冬酰胺全部替换为丝氨酸（NtoS）。流式细胞术显示表达阳性细胞比例从60.2±9.9%降至39.4±7.7%；Western blot显示NtoS胞内滞留增加，说明部分N-糖基化对有效折叠/运输是必需的。

**部分糖基化抑制和热应激增加弱flg22-TAMRA阳性群体**：衣霉素处理使FLS2LRR迁移至较低