《Journal of Chemical Information and Modeling》：Dynamics of Ligand Binding Sites and Chloride Penetration in a Bitter Taste GPCR
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味觉感知强烈影响食物选择、药物依从性和饮食行为。苦味受体属于A家族G蛋白偶联受体（GPCRs）的一个亚家族，但具有独特的特征并偏离保守基序。近期冷冻电镜（cryo-EM）结构揭示，人苦味受体TAS2R14不仅含有经典的胞外结合位点，还存在一个新颖的胞内位点，这
味觉感知强烈影响食物选择、药物依从性和饮食行为。苦味受体属于A家族G蛋白偶联受体（GPCRs）的一个亚家族，但具有独特的特征并偏离保守基序。近期冷冻电镜（cryo-EM）结构揭示，人苦味受体TAS2R14不仅含有经典的胞外结合位点，还存在一个新颖的胞内位点，这引发了关于二者相互作用的疑问。在本研究中，研究人员在显式膜环境中对TAS2R14进行了全原子分子动力学（MD）模拟，以探测不同的受体状态：胆固醇（胞外）和马兜铃酸（胞内）同时结合、仅胆固醇结合、仅马兜铃酸结合以及脱辅基受体，每种状态均在有无G蛋白的条件下进行。任一位点的配体占据均重塑了两个口袋的体积、水合状态和构象可塑性，并调节了跨膜螺旋3和6的相对接近程度。在缺乏胞内激动剂但含有胆固醇的模拟中，研究人员观察到氯离子从胞内进入并与TAS2R14保守的R55（BW位置2.50）发生长时程相互作用，揭示了一种与许多A类GPCRs中描述的D2.50-钠离子相互作用相反的电荷反转相互作用。不含G蛋白的脱辅基模拟显示，相同区域出现较短寿命的氯离子访问。综上，这些发现指出胞内口袋是未来苦味GPCRs机制研究和配体设计研究的一个有前景的靶点。
**苦味受体TAS2R14配体结合位点动态与氯离子渗透的分子模拟研究解读**
**研究背景与科学问题**
苦味感知在食物选择、药物依从性和饮食行为中发挥重要作用。苦味受体（TAS2Rs或T2Rs）属于G蛋白偶联受体（GPCRs）A家族的一个亚家族，人类中已鉴定出25种功能性苦味受体，其中TAS2R14是调谐范围最广的苦味受体，可被多种化学结构多样的配体激活。TAS2R14不仅在口腔中表达，还广泛分布于心脏、肺、生殖系统等口腔外组织，其表达广泛性暗示其具有超越味觉感知的额外生理功能。研究表明TAS2R14与结直肠癌和胰腺癌等疾病相关，因此被视为潜在的治疗靶点。
近年来，TAS2R14的冷冻电镜（cryo-EM）结构揭示了一个前所未有的特征：除了经典的胞外配体结合位点外，还存在一个额外的胞内配体结合位点。这一发现既未被计算模型预测，也未在其他已解析的苦味受体结构（如TAS2R46、TAS2R16、TAS2R43和TAS2R4）中观察到。这种异常口袋的存在挑战了传统观点对GPCR激动剂结合和激活的理解，引出了关于其功能意义及胞内外环境之间潜在相互作用的疑问。分子动力学（MD）模拟的进展表明，无偏的多微秒模拟能够可靠地采样GPCR的关键构象亚状态，并揭示离子或脂质变构位点。已有实验表明，TAS2R14的基础活性依赖于胞外口袋中胆固醇的占据，胆固醇耗竭可降低基础活性，而胆固醇补充可恢复之。
基于此，研究人员利用新解析的TAS2R14与马兜铃酸结合的冷冻电镜结构（PDB：8XQO），其中马兜铃酸占据胞内位点而胆固醇结合胞外位点，开展了分子动力学模拟研究，旨在探索这一新型胞内口袋的行为及其与胞外位点的关系。
**主要技术方法**
研究人员采用全原子分子动力学模拟方法，使用CHARMM-GUI Membrane Builder构建模拟体系，以CHARMM36m力场描述蛋白质，采用POPC脂质双层膜，溶剂为CHARMM TIP3P水并补充50 mM NaCl。基于冷冻电镜结构（PDB ID：8XQO）构建了四种受体状态体系：双配体结合（马兜铃酸和胆固醇）、仅胆固醇结合、仅马兜铃酸结合以及脱辅基状态，每种状态均包含Gα亚基，另增加一个不含Gα亚基的脱辅基体系。每个体系进行三次独立重复，每次模拟2微秒。模拟使用GROMACS软件进行。配体参数由CHARMM-GUI的Ligand Reader & Modeler模块生成，采用CGenFF力场参数。数据分析涉及口袋体积计算（POVME 3.0）、均方根偏差（RMSD）分析、接触分析、MM/GBSA结合自由能计算、均方根涨落（RMSF）分析、水分子计数分析、主成分分析（PCA）、距离及氯离子占据分析、静电表面电势计算（APBS）等。缺失的ECL2（残基162–172）和ICL3（残基217–226）环区基于AlphaFold模型重建。
**研究结果**
**口袋体积与配体效应**
体积分析显示，胞外位点含有胆固醇的状态表现出较大的口袋体积，其中仅胆固醇状态扩张最为显著；不含胆固醇的状态体积较小且分布更宽。在胞内位点，含配体状态体积较大，双配体状态具有最大的胞内体积。各状态间体积差异表明配体结合对口袋柔性具有依赖性影响，胞外位点未占据时体积分布更广。
**配体诱导的TAS2R14构象变化**
主成分分析（PCA）显示不同体系占据不同的构象区域，脱辅基和双配体状态构象多样性最小，聚集更紧凑，而其他状态分布更广，表明结构异质性增强。均方根涨落（RMSF）分析在胞内环2（ICL2）发现胆固醇的稳定作用，在跨膜螺旋6（TM6）发现马兜铃酸的去稳定作用。ECL2在所有状态中均表现出高柔性。PCA进一步揭示，含马兜铃酸状态中TM6底部向外移动而顶部向内移动，这与不含马兜铃酸的状态不同。由于TAS2Rs缺乏保守脯氨酸（6.50），TM6不会发生典型A类GPCRs的尖锐弯折，而是呈现更平滑连续的位移，类似于F类GPCRs的结构重排，这可能与TAS2R14广谱配体识别能力相关。
**TM6运动与水行为**
研究人员测量了DRY基序中Y107（3.50）与V230（6.35）之间的Cα原子距离，发现含马兜铃酸的状态距离更长，不含马兜铃酸的状态距离较短。在仅胆固醇体系中，模拟约1微秒后出现瞬时距离峰值，与TM3-TM6柔性的增加相关，这与胆固醇可弱激活TAS2R14的实验观察一致。水分子分析表明，含马兜铃酸复合物在胞内位点水占据更高，双配体复合物含水量最大，说明激动剂结合后胞内腔扩张并被水合。
**氯离子与TAS2R14的结合**
在A类GPCRs中，保守钠结合口袋通过负电性D(2.50)配位从胞外进入的钠离子来稳定非活性状态。TAS2R14相同位置却由正电荷残基R55（2.50）和H276（7.49）占据，这两种残基在人TAS2Rs中高度保守（约96%）。在50 mM NaCl对称离子环境模拟中，钠离子未表现出与受体的特定相互作用，但氯离子在缺乏马兜铃酸而存在胆固醇的条件下从胞内进入并向上迁移与R55和H276相互作用。这代表了相对于A类GPCRs的电荷反转构型：A类中正电钠离子与负电D(2.50)结合，而TAS2R14中负电氯离子与正电R(2.50)结合。静电表面分析显示TAS2R14胞内表面主要带正电，提供了有利于氯离子从胞质侧进入并导向正电残基R55和H276的静电通路。氯离子结合仅在仅胆固醇模拟中发生，而脱辅基（含Gα）和含马兜铃酸体系中未观察到。进一步的脱辅基无Gα模拟中，氯离子可重复进入相同区域但仅短暂占据，无法形成稳定相互作用；而仅胆固醇状态中，三次重复中有两次一个氯离子进入并稳定结合。
**结论与讨论**
长达2微秒的MD模拟揭示了TAS2R14结合位点的柔性，两个位点均随配体结合而扩张，这可能构成该受体容纳高度多样性配体的能力基础。研究结果表明胞外配体影响胞内位点，表现为结合口袋间构象耦合及TM3-TM6距离变化。胆固醇作为弱激动剂，其结合可能诱导胞内区域部分开放而不引发完全受体激活。PCA和RMSF分析显示不同结合状态间TM6构象差异，TM6采用不同于大多数A类GPCRs的开放模式。氯离子结合仅在仅胆固醇和脱辅基无Gα状态出现，而在脱辅基含Gα和含马兜铃酸状态中缺失，结合TM3-TM6距离增加和口袋体积增大，说明氯离子进入发生在胞内腔更可及时。这些发现揭示了TAS2R14结合位点间配体依赖性的口袋体积协变，以及在模拟条件下可被氯离子接近的、与A类GPCRs电荷反转的正电胞内区域（2.50位点周围）。该观察为胞内环境中负离子对受体功能和生理作用的潜在影响提出了新问题，同时提示TAS2R特异性精氨酸2.50位点及TAS2R14胞内区域是设计该口袋调节剂的潜在位点。研究人员指出，由于该区域静电性质尤其在H276附近可能依赖局部pH和质子化状态，当前模拟应在预定义电荷分布的限度内解释。未来需在不同氯离子浓度、更长时间尺度和不同组氨酸质子化状态及恒pH MD条件下进一步探索这一现象。随着苦味受体冷冻电镜结构及其配体复合物的不断增加，跨条件、跨配体和跨TAS2R家族成员的离子作用实验和计算探索正变得可行。
