《Journal of Proteome Research》：Sexual Dimorphism and Intraspecific Toxin Variation in Crotalus durissus terrificus Venom: Insights from Proteomics, Peptidomics, and Structural Modeling
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南美响尾蛇（Crotalus durissus terrificus，Cdt）的毒液以其精简但高度毒性的毒素组合而著称。先前已在Cdt毒液中观察到所表达的蛋白质型（proteoforms）和毒素含量的种内变异，导致异质的生物学活性。鉴于此，本研究开展了基于质谱
南美响尾蛇（Crotalus durissus terrificus，Cdt）的毒液以其精简但高度毒性的毒素组合而著称。先前已在Cdt毒液中观察到所表达的蛋白质型（proteoforms）和毒素含量的种内变异，导致异质的生物学活性。鉴于此，本研究开展了基于质谱的深入分析，并结合结构预测，以全面评估Cdt毒液的变异性和性二态性。通过肽组学分析，研究人员在Cdt毒液中鉴定出76个天然肽，其中大多数（63%）与crotoxin亚基的非经典加工有关，并通过从头测序（de novo sequencing）发现了9个新型肽。定量分析显示，雌性个体中两个来源于crotapotin的肽丰度增加，而三个新型肽在雄性个体中显著增加。通过定量蛋白质组学，研究人员鉴定了33种蛋白质的组成，其中超过三分之一的蛋白质在丰度上表现出基于性别的差异。此外，变异分析揭示了12个新型毒素变体，其丰度通常低于先前描述的蛋白质型。预测性三维结构建模揭示了保守的骨架结构，提示其生物学活性得以保留。对毒液变异性的研究为Cdt毒液的复杂变异性提供了宝贵见解，有助于理解其生物学、医学和生物技术意义。
《Journal of Proteome Research》近期发表了一项关于南美响尾蛇（Crotalus durissus terrificus，Cdt）毒液变异性与性别二态性的综合研究。蛇毒在种内和个体间表现出显著变异性，该现象源于基因重复、表达水平差异、正选择下的加速进化以及转录后和翻译后修饰等多种机制。尽管已知Cdt毒液存在个体间差异，但其在蛋白质型和毒素含量水平上的系统表征仍不充分，尤其是性别相关的差异研究有限。这种变异性不仅具有进化生物学意义，更直接影响抗蛇毒血清的效价和临床蛇伤治疗策略的制定，因此对毒液变异的深入解析具有重要的医学和生物技术意义。
研究人员对10只（5雌5雄）Cdt个体的毒液样本开展了系统的多组学分析。研究采用了肽组学、蛋白组学和结构预测相结合的策略，通过数据非依赖采集（DIA）模式进行天然肽段分析，结合TMT标记的数据依赖采集（DDA）定量蛋白质组学技术，对雌雄个体毒液组成进行了比较分析。同时，利用PEAKS Studio的SPIDER模块进行序列变异检测，并运用AlphaFold 2对变异毒素蛋白进行三维结构预测，通过计算ΔΔG稳定性评估氨基酸替换对蛋白质稳定性的影响。样本来源于巴西圣保罗州、米纳斯吉拉斯州和巴拉那州，所有个体均在人工饲养条件下维持至少三年。质谱数据已通过PRIDE数据库公开（PXD040657、PXD040735、PXD044419）。
研究结果部分涵盖以下发现：
**组成分析（SDS-PAGE）**：通过SDS-PAGE电泳分析，研究人员发现所有个体毒液呈现五条主要蛋白条带（约56、29、14和10 kDa），总体组成相对一致，但56 kDa和10 kDa条带在个体间存在显著差异。56 kDa条带对应L-氨基酸氧化酶（LAAO），仅在雌性F4和雄性M5中检测到；10 kDa区域对应crotamine，仅在两雄性个体（M2和M5）中表达量较高。
**相对定量肽组学**：通过MSE DIA的肽组学分析，从6,931个MS/MS谱图中验证了76个天然肽。其中63%（48个）来源于crotoxin——Cdt毒液的主要毒素成分，由碱性亚基CB（神经毒性磷脂酶A2）和酸性亚基CA（非酶促crotapotin）组成。此外，蛇毒丝氨酸蛋白酶（SVSP）和蛇毒金属蛋白酶（SVMP）分别占鉴定肽的12%和8%。研究还发现了9个通过从头测序鉴定的新型肽，其中FTLP[I/L]FVNPVN与C. adamanteus毒液磷酸二酯酶具有100%序列一致性。定量分析显示5个肽段在性别间存在丰度差异：两个CA β链衍生肽在雌性中高表达（FC 1.70-2.23），三个新型肽（HLLHLLQ、SSYGHLLQ、QHLLHLLQ）在雄性中富集（FC 1.98-3.25），这些新型肽呈现HLLQHLLHLLQ重复基序，提示可能来源于未表征的PLA2前体。
**Cdt肽段的蛋白水解加工**：通过分析鉴定肽段N端和C端侧翼残基（P4-P4'），研究人员发现N端甘氨酸（29%）、缬氨酸（28%）、谷氨酸（28%）以及C端苯丙氨酸P2'（26%）的高频出现，反映了CA和CB亚基N端区域在特定氨基酸位点（如亮氨酸对H/SLLQ）的可重复性蛋白水解切割模式，表明Cdt毒液中的肽段形成了特征性的蛋白水解签名。
**定量蛋白质组学**：通过TMT-DDA定量蛋白质组学，研究人员共鉴定33种蛋白质，归属16个蛋白家族。毒液以crotoxin为主（雌性74.3%，雄性63.4%），其次为crotamine、SVSP（gyroxin）、CTL、LAAO、SVMP和VEGF。12种蛋白质（约占毒液蛋白质组的1/3）表现出显著的性别差异丰度：雌性中CA和CB亚基、VEGF1、VEGF4、MAD-3a、PDE3、CRISP1和BPP前体水平较高；雄性中crotamine（平均相对丰度12% vs 雌性0.5%，FC 4.35）、VEGF3和PLB1水平显著更高。主成分分析（PCA）清晰分离了雌性、雄性和混合对照样本，进一步支持性别特异性蛋白表达图谱的存在。研究还注意到，相对宽松的fold-change阈值（|log2 FC| > 0.3）是为兼顾TMT比率压缩效应而设，以保留对毒素类别间协同变化的检测灵敏度。
**变异分析**：通过整合DIA和DDA数据并进行严格的人工谱图验证，研究人员确认了12个新型毒素变体，包括crotoxin CA和CB亚基、gyroxin、VEGF等主要毒素的氨基酸替换。大部分替换为单个残基替换，且除VEGF4的I104N外均可归因于单核苷酸多态性（SNP）。值得注意的是，CB的丙氨酸插入（A23）可能源于核苷酸插入事件。DIA和DDA方法在变异检测上呈互补性：CA变体仅由DIA检出，CB变体仅由DDA检出，唯gyroxin的S136N在两个平台均有发现。定量比较显示8个变异肽段与其天然对应肽段存在显著丰度差异。
**突变对三维结构和蛋白质稳定性的影响**：通过AlphaFold 2结构预测和叠加比对，所有变异蛋白均展现出与天然晶体结构高度保守的三维折叠。叠加残基的局部均方根偏差（RMSD）低至0.05 ?，突变残基区域具有高置信度pLDDT（>80%）评分。单个错义突变的ΔΔG稳定性预测显示了从稳定化（如CB F61Y的-0.71 kcal/mol）到去稳定化的效应谱，然而当综合考虑多重突变时（如F61Y与S/H-F21Y的组合），整体蛋白质稳定性呈现改善趋势（ΔΔG分别增至0.60和0.62 kcal/mol），支持这些替换可能来源于共同的前体蛋白。变异位点未发生在关键接触残基（crotoxin）、催化口袋（thrombin-like酶）或受体结合环（VEGF）等功能关键区域，提示变异可能不会显著影响毒素的生物学活性。
**讨论与结论**：研究结果表明，Cdt毒液的个体间和性别间差异并非随机的，而是由精细的基因表达调控网络所驱动。雄性中crotamine的高水平与较低的crotoxin和MAD-3a丰度相关联，与先前关于crotamine阳性个体特征的描述一致。crotamine在所有个体中的可检测性（包括先前认为crotamine阴性者）提示基于质谱的蛋白质组学方法可能比传统检测方法对这类富含多碱性残基的小分子毒素更为灵敏。研究进一步支持平衡选择在维持毒液毒素等位基因多样性中的作用，不同于定向正选择导致高适应度等位基因固定的传统观点。高丰度蛋白受到更强的正选择和松弛选择约束，促进了突变累积和表型空间扩展。通过质谱分析进行的大规模蛋白质型（proteoform）特征描绘，正在成为表征毒液复杂性的重要手段。
本研究首次在个体水平上对Cdt毒液进行了TMT标记的定量蛋白质组学综合分析，结合肽组学、从头测序和结构预测，系统揭示了毒液组成的性别二态性和蛋白质型变异图谱。研究鉴定的新型肽和变异体扩展了Cdt毒液毒素多样性的已知范围，保守的结构骨架提示其生物学功能得以维持。这些发现不仅加深了对蛇毒进化多样性和性别二态性的理解，也对抗蛇毒血清的研发策略具有指导意义——考虑到性别相关的毒液组成差异对血清中和效力的潜在影响，以及更广泛的生物医学和生物技术应用价值。然而，样本量（每性别5只）限制了对性别差异的普适性推论，年龄和地理来源亦为潜在混杂因素，未来需要更大规模、地理匹配的队列研究来进一步厘清性别、个体发育和地理因素对Cdt毒液变异的相对贡献。
