经静脉输注的多系分化持续应激（Muse）细胞减轻具有支气管肺发育不良特征的大鼠模型中高氧诱导的肺损伤

《Stem Cell Research & Therapy》：Intravenously delivered multilineage-differentiating stress-enduring cells dampen hyperoxia-induced lung injury in a rat model with features of bronchopulmonary dysplasia

　　

背景：新生儿支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是一种由宫内炎症、机械通气和氧化应激等多种因素引起的肺损伤。BPD可导致严重的呼吸和神经功能障碍及死亡。近期，一些临床试验已开始采用静脉输注供者来源的多系分化持续应激（multilineage-differentiating stress enduring, Muse）细胞。本研究旨在探讨人Muse细胞在具有BPD特征的大鼠模型中治疗高氧诱导的新生儿肺损伤的效果。

方法：大鼠出生后24小时内放入培养箱，暴露于高氧（83%）直至出生后第15天。Muse细胞和非Muse细胞分别从骨髓间充质基质细胞（bone marrow-mesenchymal stromal cells, MSCs）中分选为阶段特异性胚胎抗原-3（stage-specific embryonic antigen-3, SSEA-3）⁺和SSEA-3^?，于出生后第5天经右侧颈外静脉或气管（仅Muse细胞）缓慢输注。对照组仅给予醋酸林格氏液。

结果：静脉输注与气管内输注在呼吸功能、组织学表现和炎症参数方面无显著差异。相反，气管内输注后体重增长和存活率较差。与非Muse细胞相比，静脉输注Muse细胞在减轻肺组织损伤、炎症和肺动脉高压方面效果更优。研究人员还确认了Muse细胞在肺组织中的植入。蛋白质组学分析鉴定了与高氧诱导肺损伤相关的蛋白质丰度变化，这些蛋白质注释为细胞黏附和凝血/纤溶相关通路，而Muse细胞输注与这些蛋白质亚群的差异丰度相关。

结论：研究结果表明，静脉输注Muse细胞在具有BPD特征的大鼠模型中为高氧诱导的肺损伤提供了功能改善。

该研究发表于《Stem Cell Research》。支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是早产儿常见的慢性肺损伤疾病，其发病与宫内炎症、机械通气和氧化应激等多种因素有关。BPD可导致严重的呼吸和神经功能障碍，甚至死亡。尽管新生儿救治水平提高，极低出生体重儿存活率上升，但BPD发生率仍居高不下，且目前缺乏确切有效的治疗方法。全身性类固醇虽有一定短期疗效，但存在神经发育不良的风险。因此，开发新的治疗策略十分迫切。

近年来，干细胞治疗为BPD带来新希望。间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）是BPD干细胞治疗的主要细胞来源，但临床试验显示其降低死亡或中重度BPD风险的效果尚不充分。多系分化持续应激（multilineage-differentiating stress enduring, Muse）细胞是MSCs中的亚群，表达阶段特异性胚胎抗原-3（stage-specific embryonic antigen-3, SSEA-3），具有内源性类多能性和向损伤组织特异性归巢的能力。Muse细胞还可吞噬凋亡细胞并分化为相应组织细胞，同时具有旁分泌和免疫抑制特性。本研究旨在评估人Muse细胞经静脉输注对高氧诱导的大鼠BPD模型的治疗效果，并与非Muse细胞及不同给药途径进行比较。

主要技术方法包括：研究人员将新生SD大鼠自出生24小时内置于83%高氧环境中至生后第15天，建立BPD样肺损伤模型；通过荧光激活细胞分选（fluorescence activated cell sorter, FACS）从人骨髓MSCs（购自Lonza）中分离SSEA-3⁺ Muse细胞和SSEA-3^?非Muse细胞，于生后第5天经右颈外静脉或气管输注；利用全身体积描记法（whole body plethysmography, WBP）检测呼吸功能，组织形态计量评估肺组织体积密度（tissue volume density, TVD），支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）细胞计数和免疫荧光评估炎症，Alu序列定量PCR检测细胞分布，右心室/左心室+室间隔（RV/LV+IVS）重量比和右心室收缩压（right ventricular systolic pressure, RVSP）评估肺动脉高压，TMT标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析。

### 静脉输注与气管内输注的比较
研究人员比较了Muse细胞经静脉和气管内两种途径输注的效果。结果显示，两种途径在潮气量（tidal volume, TV）、TVD和BALF白细胞计数方面无显著差异，但气管内输注组大鼠体重增长和存活率显著低于对照组。这表明在该模型中，静脉输注比气管内输注更具安全性。

### Muse与非Muse细胞静脉输注的比较
研究人员比较了静脉输注Muse细胞、非Muse细胞和载体对高氧肺损伤的影响。Muse细胞显著改善了高氧引起的TVD降低，而非Muse细胞组无显著改善；Muse细胞显著降低BALF中白细胞和巨噬细胞计数，非Muse细胞组无显著差异。TV在Muse组有改善趋势但未达统计学显著（p=0.053）。此外，Muse细胞还降低了肺组织中ED1⁺ iNOS⁺炎性巨噬细胞数量及血清TNF-α水平。

### Muse细胞在肺组织中的分布与植入
Alu-qPCR检测显示，Muse细胞在肺、脑、肝、脾中均有人源DNA检出，肺中含量最高，且显著高于非Muse组。免疫荧光染色证实，Muse细胞在肺组织中植入数量显著多于非Muse细胞，且Muse细胞形态多呈扁平状，而非Muse细胞多呈球形。部分GFP标记的Muse细胞表达人podoplanin（I型肺泡上皮细胞标志）和hPE10（II型肺泡上皮细胞标志），提示其向肺泡上皮细胞分化。

### 肺动脉高压评估
在肺动脉高压方面，Muse组RV/LV+IVS和RVSP均较载体组显著降低，而非Muse组无显著改善，表明Muse细胞可缓解高氧诱导的肺动脉高压。

### 蛋白质组学分析
蛋白质组学共鉴定2694个蛋白，其中844个受高氧影响。Muse细胞输注影响其中141个蛋白（富集比为2.69），非Muse细胞影响223个（富集比为2.15）。功能富集分析显示，细胞黏附相关和凝血/纤溶系统相关通路在高氧影响蛋白及Muse细胞响应蛋白中显著富集，而在非Muse响应蛋白中未富集。网络分析确定Ctnnb1为细胞黏附网络的核心分子；免疫荧光显示Muse细胞邻近的肺泡上皮细胞Ctnnb1表达上调，Anxa1阳性细胞在Muse组显著增多。凝血/纤溶通路中，Muse细胞上调了部分抑制凝血和促进血管舒张的蛋白（如Kng1、Gnai3、Sod2等）。进一步通过红细胞和血小板标志物分析排除了残留血液对凝血信号的混杂影响。

讨论指出，Muse细胞较非Muse细胞具有更强的归巢、植入和分化为肺泡上皮细胞的能力，其治疗作用可能涉及直接细胞替代、旁分泌效应以及对细胞黏附和凝血/纤溶通路的调节。Ctnnb1介导的Wnt/β-catenin信号通路和Anxa1的抗炎作用可能是关键机制。该研究存在局限性，包括高氧模型不能完全模拟临床BPD的复杂性，以及气管内给药可能带来操作相关的不良影响。

研究结论：静脉输注Muse细胞在高氧诱导的BPD样肺损伤模型中显示出优于非Muse细胞的治疗效果，改善呼吸功能和肺动脉高压，伴随向肺泡上皮细胞分化以及细胞黏附和凝血通路的调节。研究结果提示，Muse细胞疗法有望成为治疗严重新生儿肺疾病的有前景的方法，有必要进一步开展转化和临床研究以验证这些结果。