激肽释放酶-激肽系统调节CD4+ T细胞功能并促进卒中后T细胞向脑内迁移

《Journal of Neuroinflammation》：The kallikrein-kinin system modulates CD4+ T cell function and contributes to T cell migration into the brain after stroke

　　

缺血性卒中引发持续的血栓炎症反应，该反应严重塑造继发性脑损伤。激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system, KKS）已被确定为血管损伤与炎症过程之间的接口；然而，其在适应性免疫中的作用仍不明确。在此，研究人员表明KKS与致病性CD4⁺ T细胞活化和转运相关。在缺血性卒中患者和经受短暂大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）的小鼠中，循环CD4⁺ T细胞表现出保守的、活化的且具备转运能力的表型，其特征在于粘附/迁移标志物上调，表明存在跨物种保存的系统性适应性免疫反应。在功能上，取自亚急性期接受血浆激肽释放酶（plasma kallikrein, PK）中和抗体（ɑPK）治疗的卒中小鼠的血清，在体外减弱了CD4⁺ T细胞活化、增殖、粘附/迁移标志物表达以及促炎细胞因子产生。PK选择性增强CD4⁺ T细胞粘附和迁移，而其下游代谢产物Des-Arg9-缓激肽（Des-Arg9-bradykinin, Des-Arg9-BK）诱导明显的促炎、促迁移表型，并在体外增强趋化因子驱动的跨内皮迁移。引人注目的是，体内延迟PK抑制与缺血脑中T细胞积聚减少和循环CD4⁺ T细胞频率增加相关，提示中枢神经系统（central nervous system, CNS）浸润动力学受损。总之，这些发现支持KKS信号通过增强内皮粘附性和促进CD4⁺ T细胞向缺血组织迁移，在缺血性卒中后塑造神经免疫相互作用中发挥作用。通过连接血栓炎症和适应性免疫，KKS成为选择性调节神经免疫相互作用并可能改善缺血性卒中后功能恢复的有前景的治疗靶点。

论文解读：激肽释放酶-激肽系统调节CD4⁺ T细胞功能并促进卒中后T细胞向脑内迁移

缺血性卒中是全球日益严峻的公共卫生挑战，每年新增数百万病例，其中绝大多数为缺血性。当前标准治疗（静脉溶栓和血管内机械取栓）聚焦于快速再灌注和血流恢复，但并未直接干预缺血事件后复杂的血栓炎症环境，因此继发性损伤和功能恢复仍是难题。免疫系统在卒中恢复中发挥关键作用。缺血后脑细胞释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），激活内皮细胞，促进白细胞浸润、组织水肿、血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）破坏和进行性脑损伤。T细胞，尤其是CD4⁺辅助T细胞，通过产生细胞因子和激活胶质细胞驱动促炎反应，加重脑组织损伤。T细胞向中枢神经系统（central nervous system, CNS）的迁移由整合素和趋化因子等介导的级联黏附事件调控。激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system, KKS）已被确定为凝血、炎症和血管病理之间的关键接口，调节血栓形成、血管通透性和BBB完整性。实验性抑制血浆激肽释放酶（plasma kallikrein, PK）可减小梗死体积并改善神经功能，但KKS对适应性免疫特别是T细胞募集的直接作用尚未明确。因此，该研究旨在探讨PK抑制对T细胞反应和功能的直接影响，以揭示血管损伤与炎症反应之间的复杂界面，并评估KKS作为治疗靶点的潜力。该论文发表在《Journal of Neuroinflammation》。

研究人员使用了来自缺血性卒中患者（德国埃森大学医院伦理委员会批准，编号21-10271-BO）和健康对照的外周血样本，以及小鼠短暂大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）模型。主要技术方法包括：流式细胞术分析T细胞活化、增殖和黏附/迁移标志物；Luminex技术定量细胞因子；体外T细胞培养并给予PK、Des-Arg9-BK或αPK处理小鼠血清；transwell迁移实验评估T细胞定向迁移和跨内皮迁移；体内CD45-eFluor450标记区分早期和晚期浸润T细胞；MRI测量梗死体积；神经功能评分；免疫荧光组织学计数脑内CD3⁺ T细胞；PCR检测激肽受体表达；跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance, TEER）测量内皮屏障完整性。

研究结果如下：

**Enhanced activation and trafficking-associated phenotype of CD4+ T cells following ischemic stroke**
通过流式细胞术分析卒中患者发病后2–4天和tMCAO小鼠术后第3天的外周血CD4⁺ T细胞，发现患者和小鼠均出现CD69、LFA-1、VLA-4等活化及黏附/迁移标志物表达上调，且患者5–7天时CD69和LFA-1仍升高，表明卒中后存在跨物种保守的系统性适应性免疫激活和迁移能力增强。

**Serum from αPK-treated tMCAO mice modulates CD4+ T cell responses in vitro**
将αPK治疗小鼠的血清加入αCD3/αCD28刺激的脾脏CD4⁺CD25^? T细胞，发现CD25、CD69、CD44等活化标志物降低，增殖减弱，CXCR4、LFA-1、VLA-4等黏附/迁移分子下调，IFN-γ、TNF-α、IL-2分泌减少，说明PK抑制改变了卒中后全身环境，在体外减弱T细胞促炎功能。

**KKS components directly modulate CD4+ T cell function and phenotype**
用PK直接处理活化T细胞，发现PK浓度依赖性地增加黏附/迁移标志物表达，但不影响活化和增殖；而其下游代谢物Des-Arg9-BK则强烈诱导T细胞活化、增殖、黏附/迁移分子上调和促炎细胞因子分泌。T细胞表达激肽受体B1R和B2R，说明Des-Arg9-BK可直接作用于T细胞。

**Des-Arg9-BK enhances CD4+ T cell adhesion and migration capacity**
Transwell实验显示，PK预处理增加SDF-1β定向迁移，Des-Arg9-BK预处理同样增强迁移，并增加T细胞对内皮单层的黏附及跨内皮迁移。TEER测量排除了内皮屏障破坏的影响，表明KKS信号直接增强CD4⁺ T细胞的迁移能力。

**αPK treatment increases circulating T cell frequencies after stroke**
在tMCAO小鼠第3天开始延迟给予αPK，第7天检测显示外周血CD3⁺和CD4⁺ T细胞比例增加，但单个细胞的活化、增殖和黏附/迁移标志物无显著变化，提示αPK治疗导致循环T细胞积累，可能由于CNS浸润减少。

**αPK treatment prevents T cell infiltration into the brain after stroke**
αPK治疗显著减小第7天梗死体积并改善神经功能。脑组织免疫荧光显示αPK组脑实质CD3⁺ T细胞数量较IgG组减少。体内CD45标记实验表明，早期和晚期浸润的CD3⁺ T细胞均减少，且浸润T细胞数量与神经功能改善相关，证实时PK抑制限制了T细胞向缺血脑组织的迁移。

在讨论部分，研究人员总结指出，缺血性卒中后循环CD4⁺ T细胞发生系统性活化和迁移表型转换，KKS通过PK和Des-Arg9-BK信号直接增强T细胞黏附与迁移，同时调节内皮细胞和T细胞上的黏附分子，从而促进T细胞进入脑实质。延迟PK抑制可减少T细胞在缺血半球的积聚而不引起全身免疫抑制，提示KKS是连接血栓炎症和适应性免疫的重要枢纽。研究也承认局限性，包括未探索KKS与肾素-血管紧张素系统的相互作用，以及长期效应尚不清楚。

研究结论部分翻译如下：总之，研究人员建立了一个先前未被认识的KKS信号与CD4⁺ T细胞反应之间的功能关系，该关系将血栓炎症与卒中后适应性免疫联系起来。体外研究结果表明，KKS信号调节参与CD4⁺ T细胞活化和转运的过程，而体内效应可能涉及内皮相关和T细胞相关机制。药理学抑制PK与缺血半球T细胞积聚减少相关，且无全身免疫抑制的证据。总的来说，这些观察将KKS定位为神经免疫相互作用的重要调节因子，并支持其作为调节卒中后有害T细胞相关反应的潜在治疗靶点。