《International Microbiology》：Cultivable diversity and plant growth-promoting traits of free-living bacteria from coffee soils under contrasting fertilization systems
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巴西咖啡生产高度依赖矿物肥料，尤其是氮基投入品。然而，这些肥料的集约化使用与养分损失、生产成本升高及环境影响相关联，凸显了对更可持续替代方案的需求。在此背景下，促植物生长细菌（PGPB）代表了提高养分利用效率和减少对合成投入品依赖的有前景资源。然而，在不同施肥
巴西咖啡生产高度依赖矿物肥料，尤其是氮基投入品。然而，这些肥料的集约化使用与养分损失、生产成本升高及环境影响相关联，凸显了对更可持续替代方案的需求。在此背景下，促植物生长细菌（PGPB）代表了提高养分利用效率和减少对合成投入品依赖的有前景资源。然而，在不同施肥管理制度下，与咖啡土壤相关的可培养细菌类群仍未得到充分表征。本研究的目标是从常规矿物施肥（CMF）和有机施肥管理下的咖啡（Coffea arabica）土壤中分离、鉴定和表征可培养细菌分离株，并筛选其促植物生长特性。共获得38株细菌分离株，并通过16S rRNA基因的Sanger测序进行鉴定。两种施肥制度共享优势细菌类群，但每种管理方式均含有独有细菌属。来自有机施肥的11株细菌分离株和来自CMF的9株细菌分离株在无氮半固体NFb培养基中表现出生长能力。所有来自有机施肥的分离株及若干来自CMF的分离株能够溶解磷酸三钙。此外，两种施肥制度下获得的细菌分离株在吲哚乙酸产生方面未观察到显著差异。总体而言，与两种管理制度相关的可培养细菌类群表现出显著的功能多样性，并包含具有多重促植物生长特性的多功能分离株。这些发现拓展了目前关于咖啡土壤中可培养细菌多样性的知识，并突显了本地微生物群作为未来适用于可持续咖啡生产的微生物菌剂和微生物联合体的候选微生物的重要来源。
**不同施肥制度下咖啡土壤可培养细菌多样性及其促植物生长特性的综合解读**
**一、研究背景与科学问题**
巴西作为全球最大的咖啡生产国，拥有约225万公顷的咖啡种植面积。咖啡生产系统的高生产力在很大程度上依赖于矿物施肥，以满足作物对氮（N）、磷（P）、钾（K）等营养元素的需求。其中，氮在植物代谢中发挥核心作用，是蛋白质、核酸、叶绿素及多种参与光合作用和能量代谢的关键辅因子的结构组分。在传统的全日照单作栽培模式下，咖啡植株在整个生产周期中对氮的需求量极高，尤其是在营养生长、开花和果实灌浆阶段。在集约化生产系统中，这一需求主要通过施用化学合成氮肥来满足。然而，这些投入品的利用效率常因氮素通过淋溶、挥发和反硝化途径的损失而大打折扣，从而导致生产成本上升并造成显著的环境影响。
上述局限性促使研究人员探索能够提高养分利用效率、同时减少对合成肥料依赖的更可持续策略。在此背景下，土壤作为咖啡生产系统的基本组成，其微生物群落在养分循环、有机质分解和土壤肥力维持等方面发挥着至关重要的作用。土壤微生物群落的结构、多样性和功能受到环境条件和农业管理的强烈影响，这些因素作为生态过滤器选择适应不同养分状况的微生物。长期施用化学合成矿物肥料通常与微生物多样性降低、功能冗余度下降和土壤生物稳定性减弱相关联，同时还会促进土壤酸化。相反，采用有机改良物的施肥策略通常能增加土壤有机碳的有效性，促进更大的生境异质性，并有利于建立更多样化和功能上更具恢复力的微生物群落。
在土壤微生物中，促植物生长细菌（PGPB）通过多种机制促进植物营养和健康，包括生物固氮、磷酸盐溶解、植物激素产生、养分 mobilization 以及植物病原菌抑制等。若干细菌属包含能够通过固氮酶介导的生物固氮作用为农业土壤氮素有效性做出贡献的自由生活固氮代表类群。然而，这些微生物常同时表现出多种促植物生长特性，使其成为开发微生物菌剂的有吸引力的候选对象。尽管非培养依赖的方法已大幅拓展了与咖啡相关的微生物群落知识，但可培养细菌分离株的获得对于实验验证微生物功能以及将生态学知识转化为实际农业应用仍然不可或缺。
然而，在不同施肥管理制度下，与咖啡土壤相关的可培养细菌类群的研究仍然十分匮乏。因此，本研究旨在从常规矿物施肥（CMF）和有机施肥管理下的咖啡（Coffea arabica）土壤中分离、鉴定和表征可培养细菌分离株，并筛选其促植物生长特性，包括无氮半固体培养基中的生长能力、磷酸盐溶解能力和吲哚-3-乙酸（IAA）产生能力。
**二、研究主要技术方法**
本研究在巴西米纳斯吉拉斯州阿拉蓬加市的咖啡种植区开展，选取了有机施肥和常规矿物施肥两种管理方式的阿拉比卡咖啡品种Catuaí Vermelho种植区域。研究人员在每块样地设置十个采样点，采集非根际（bulk）土壤样品，每份复合样品作为一个实验单元。通过使用无氮的LGI和JMV培养基进行细菌分离培养，采用平板涂布法获得纯培养物。细菌分离株的分子鉴定基于16S rRNA基因的PCR扩增和Sanger毛细管电泳测序，利用Geneious?软件组装序列，并通过最大似然法构建系统发育树进行分类学鉴定。促植物生长特性的体外筛选包括：在无氮半固体NFb培养基中评估潜在固氮能力；在含有磷酸三钙的固体NBRIP培养基上评估无机磷酸盐溶解能力并计算溶解指数（SI）；以及采用Salkowski比色法在添加L-色氨酸的TSB培养基中定量IAA产生量。所有促植物生长特性数据均进行生物学三重复实验，并采用方差分析（ANOVA）和Scott–Knott事后检验进行统计分析。
**三、研究结果**
**可培养细菌分离株的分子鉴定与系统发育分析**
从两种施肥制度中共获得38株可培养细菌分离株，每种管理方式各19株。基于多序列比对，这些细菌分离株归属于4个门和15个细菌属。两种施肥制度下的多数细菌分离株属于 Pseudomonadota 和 Actinomycetota 门。相比之下，来自 Bacillota 和 Bacteroidota 门的细菌分离株仅在有机施肥土壤中被发现。此外，共有34株细菌分离株在属水平上成功分类，而4株分离株（TO_12、TC_05、TC_09和TC_10）因Sanger测序读段质量较差，出现高背景噪声和重叠双峰，无法进行准确的contig组装，因此未能获得属级分类。有机施肥制度产生的分离株归属于十个细菌属，包括 Pseudomonas、Streptomyces、Paraburkholderia、Priestia、Flavobacterium、Acinetobacter、Curtobacterium 和 Dyella。常规矿物施肥制度下的分离株同样归属于十个属： Streptomyces、Pseudomonas、Burkholderia、Ralstonia、Acinetobacter、Luteibacter、Kosakonia、Sphingobacterium、Bacillus 和 Rhizobium。三种属（Pseudomonas、Streptomyces 和 Acinetobacter）为两种施肥制度共有，而 Paraburkholderia、Priestia、Flavobacterium、Curtobacterium 和 Dyella 仅在有机施肥土壤中检出。相反，Burkholderia、Ralstonia、Luteibacter、Kosakonia 和 Rhizobium 仅在常规矿物施肥土壤中被发现。
**无氮培养基中的生长与潜在固氮能力**
总体上，两种施肥制度之间在NFb培养基中表现出生长能力的分离株数量相近，有机施肥土壤中获得11株阳性分离株，常规矿物施肥中获得9株。归属于 Flavobacterium、Streptomyces、Curtobacterium、Priestia 和 Dyella 属的其余分离株在NFb筛选试验中未表现出阳性反应。在常规矿物施肥获得的分离株中，9株显示阳性生长，包括 Rhizobium（TC_01）、Streptomyces（TC_02和TC_18）、Kosakonia（TC_03）、Pseudomonas（TC_04、TC_13和TC_15）、Luteibacter（TC_21）以及一株未鉴定分离株（TC_09）。相比之下，归属于 Burkholderia（TC_06）、Streptomyces（TC_07、TC_08、TC_19和TC_22）、Ralstonia（TC_12）和 Acinetobacter（TC_20）的分离株在NFb筛选试验中未表现出阳性生长。
**无机磷酸盐溶解能力**
所有从有机施肥土壤中获得的细菌分离株均能在体外溶解磷酸三钙，这通过在选定菌落周围观察到清晰的溶解圈得到证实。然而，不同分离株的溶解效率存在差异。Streptomyces（TO_06）、Bacillus（TO_07）、Flavobacterium（TO_05）和 Acinetobacter（TO_03）表现出最高的溶解指数，SI值分别为4.5、4.2、3.8和3.8，被归类为高效磷酸盐溶解菌（SI > 3）。总体而言，来自有机施肥土壤的4株分离株被归类为高效磷酸盐溶解菌，而其余分离株根据采用的分类标准表现出中或低的溶解效率。类似地，从常规矿物施肥中获得的分离株也表现出磷酸盐溶解活性。其中，Streptomyces（TC_22）、Acinetobacter（TC_20）和 Pseudomonas（TC_13）表现出最高的溶解效率，SI值范围为3.0至3.6，属于高效溶解类别。该管理制度下共有3株分离株被归类为高效磷酸盐溶解菌。尽管两种管理制度中均鉴定出高效溶解分离株，但有机施肥土壤产生了数量略多的被归类为高效磷酸盐溶解菌的分离株。
**吲哚-3-乙酸（IAA）产生能力**
两种施肥制度之间在IAA产生方面未观察到显著差异（p > 0.05）。然而，各管理制度内不同细菌分离株之间的IAA产生量存在显著差异。在有机施肥土壤获得的分离株中，Priestia（TO_19）、Dyella（TO_20）、Paraburkholderia（TO_02）和 Bacillus（TO_07）表现出最高的IAA产生量。同样，在常规矿物施肥获得的分离株中，Streptomyces（TC_02和TC_14）和 Luteibacter（TC_21）产生了最高的IAA浓度。总体而言，两种施肥制度中均鉴定出高IAA产生量的分离株，表明合成这种植物激素的能力分布在分类学上不同的细菌属中，且不受施肥管理方式的影响。
**四、讨论与结论**
本研究的分类学鉴定保守地解析到属水平，因为16S rRNA基因测序所提供的系统发育分辨率可能不足以进行可靠的种水平区分，特别是在密切相关的细菌类群之间。尽管两种施肥制度共享优势细菌门和若干细菌属，但每种管理方式也拥有独有类群，这表明施肥实践与所获得的可培养细菌分离株的不同谱系相关，而并未显著改变这一可培养类群的优势分类结构。这一模式可能反映了两种咖啡生产系统的长期建立，它们可能维持了适应咖啡种植的稳定核心微生物群，而养分动态和有机投入物的差异可能选择管理特异性的细菌种群。
在两种施肥制度中 Pseudomonadota 和 Actinomycetota 门分离株的优势地位表明，这些类群代表了与咖啡土壤相关的可培养细菌部分的稳定组分。有机施肥产生了 Paraburkholderia、Priestia、Flavobacterium、Curtobacterium 和 Dyella 的独有分离株，而 Rhizobium、Burkholderia、Ralstonia、Luteibacter 和 Kosakonia 仅在CMF下被发现。从有机施肥土壤中回收 Bacillota 和 Bacteroidota 门的细菌分离株表明，与常规矿物施肥相比，其在门水平上具有更广泛的分类学代表性。有机施肥通常增加土壤有机碳和养分异质性，创造更多样化的生态位，可能有利于回收更广谱的可培养、代谢多样的细菌分离株。相反，矿物施肥提供速效养分，倾向于 favor 能够迅速利用短暂养分脉冲的快速生长的嗜营养微生物。
体外生理测定揭示了可培养细菌分离株中相当大的功能多样性。在无氮半固体NFb培养基中表现出生长能力（指示潜在的固氮表型）、磷酸盐溶解活性和IAA产生的分离株从两种施肥制度中均被回收。尽管这些测定代表了初步的功能筛选，但单个分离株内多种促植物生长特性的共存突显了它们作为未来微生物联合体和生物菌剂开发研究候选对象的潜力。磷酸盐溶解活性和IAA产生进一步印证了与咖啡土壤相关的可培养细菌的功能多样性。IAA产生在归属于 Streptomyces 的分离株中尤为突出，其浓度高达68.82 μg mL?1，超过了先前报道的变青链霉菌和 Streptomyces VSMGT1014 的值。Priestia 和 Dyella 的分离株也观察到高IAA产生，加强了这些属的生物技术潜力。
综上所述，施肥管理与从咖啡土壤中回收的可培养细菌分离株的不同谱系和分类学代表性相关联，同时两种管理制度之间维持了共享的优势细菌类群核心。有机施肥和常规矿物施肥均含有表现出促植物生长特性的细菌分离株，包括在无氮半固体培养基中的生长、磷酸盐溶解和吲哚-3-乙酸产生，证明了与咖啡种植相关的可培养微生物群的功能多样性。从两种施肥制度中回收多功能细菌分离株突显了本地咖啡土壤微生物群的生物技术潜力，作为未来适应本地生态气候条件的微生物菌剂和微生物联合体候选物的宝贵来源。尽管需要额外的功能验证（包括nif基因的分子检测和定量固氮测定）以及温室和田间评估来确认真正的固氮能力和农艺表现，本研究拓展了目前关于与咖啡土壤相关的可培养细菌多样性的知识，并为开发可持续咖啡生产的微生物技术提供了基础。该论文发表在《International Microbiology》。
