法国家系中ARPP21被鉴定为肌萎缩侧索硬化主要相关基因的家族性、神经病理学及细胞学分析

《Acta Neuropathologica》：Familial, neuropathological and cellular analysis identify ARPP21 as a major amyotrophic lateral sclerosis associated gene in French cohorts

　　

摘要
ARPP21近期被发现为一个新的肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）相关基因，但其致病作用仍不明确。在本研究中，研究人员进行了家族性、临床、神经病理学和细胞学分析，以鉴定法国ALS队列中复发的p.P529L和p.P713L变异（分别又称p.P563L变异和p.P747L变异），该队列包含1190例ALS病例及另外50名可用于分离分析的家庭成员，共描述了29例ARPP21相关患者。在排除四个主要ALS基因后，ARPP21成为法国最常见的罕见ALS相关基因，占家族性病例（fALS）的2.7%和散发性病例的0.1%。年龄依赖性外显率在50岁时达到45%，此后仅适度增加，即使在高龄阶段仍保持不完全外显。在细胞模型中，p.P713L突变体表现出聚集现象，并伴有蛋白过度磷酸化及与自噬标志物p62的共定位。对一例p.P529L携带者组织的神经病理学检查显示典型的胞质TDP-43病理改变，同时存在异质性ARPP21阳性沉积物。由于ARPP21抗体亦可染色颗粒空泡变性结构，ARPP21阳性沉积物可能反映神经元应激而非突变ARPP21特异性病理改变。尽管如此，结合既往研究，本研究发现支持ARPP21是一个重要的ALS相关基因，并表明p.P529L/p.P563L和p.P713L/p.P747L均应被视为致病的ALS相关变异。将ARPP21纳入fALS的常规基因检测组合可提高诊断率。

论文解读：ARPP21为法国家族性肌萎缩侧索硬化重要相关基因——遗传、神经病理与细胞学综合证据

一、研究背景与科学问题

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是最常见的成人起病运动神经元疾病，以大脑皮层、脑干和脊髓中上、下运动神经元的进行性退变为特征，最终导致完全瘫痪和呼吸衰竭。约90%的ALS病例为散发性，被视为多因素疾病；约10%为家族遗传性，呈常染色体显性遗传模式。目前，针对铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）或肉瘤融合蛋白（FUS）基因致病性变异携带者的靶向反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）疗法已开发并在特定临床场景中应用，其目的在于减少毒性蛋白的积累。随着基因靶向技术的持续进步，更多ALS相关基因有望成为治疗干预的靶点，因此识别这些遗传学决定因素具有重要的转化意义。然而，即使经过对四个主要ALS基因（C9orf72六核苷酸重复扩增及SOD1、TARDBP、FUS点突变）的筛查，仍有约三分之一的家族性ALS病例遗传病因不明，亟需深入研究。

近年来，通过全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）和全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）策略，已在大型ALS家系或病例-对照罕见变异负荷分析中发现了多个罕见遗传贡献基因。ARPP21编码环磷酸腺苷（cyclic AMP, cAMP）调节的磷酸化蛋白21，近期在最大规模的WES分析（含17,919例ALS病例和200,703例对照）中被鉴定为高效应的ALS相关变异基因。此前亦有来自英国、荷兰、比利时和西班牙的散发病例报道，以及西班牙东北部一个省份七个家系的聚集性病例报道。但该基因的致病作用尚不明确，既往部分携带ARPP21变异的患者同时携带其他ALS相关基因变异（如GLT8D1、CFAP410、KIF5A、NEK1、TBK1），提示可能存在寡基因遗传或修饰变异的影响。在此背景下，本研究在独立的大型法国ALS队列中，通过互补的家族性、临床、神经病理学和细胞学分析，对ARPP21变异的致病性进行了系统性再评估。

二、主要研究内容与结论概述

研究人员在法国ALS队列中进行了多层次的综合研究。该队列包含1190例已排除四个主要ALS基因（C9orf72、SOD1、TARDBP和FUS）致病性变异的ALS患者，其中300例为家族性先证者，890例为散发性病例。通过WES分析、Sanger测序验证、单倍型分析、神经病理学检查、细胞转染实验、免疫印迹和统计学分析，研究人员在8个无亲缘关系的家系中鉴定出复发的p.P529L/p.P563L（5个家系）和p.P713L/p.P747L（3个家系）变异，共涉及29例患者。ARPP21因此成为法国人群中排除了四个主要ALS基因后最常见的罕见ALS相关基因，占家族性病例的2.7%（8/300）和散发性病例的0.1%（1/890）。年龄依赖性外显率分析显示，50岁时外显率约为45%，60岁时约为50%，高龄时仅缓慢增加至55%，即使在晚年仍存在不完全外显。该研究证实了ARPP21为ALS的重要致病基因，并支持将ARPP21纳入家族性ALS的常规基因检测组合以提高诊断效能。

三、主要关键技术方法

本研究采用了多项关键技术方法：（1）遗传学分析方面，对540例患者（含300例fALS先证者、100例尸检sALS患者和140例早发sALS患者）及50例患病家系成员进行WES，并在650例额外sALS病例中进行靶向Sanger测序筛查；对可用DNA的家系成员（包括未患病者）进行共分离分析；利用ARPP21基因内部或附近的微卫星标记进行单倍型分析。（2）神经病理学分析方面，对来自Brainbank Neuro-CEB（巴黎）的尸检组织进行甲醛固定、石蜡包埋、苏木素-伊红（HE）和Luxol固蓝染色，并使用Ventana Benchmark UltraPlus自动化系统进行免疫组织化学检测，使用抗TDP-43、磷酸化TDP-43、p62/SQSTM1、囊泡蛋白C（cystatin-C）、ARPP21等抗体，并进行双标免疫组化。（3）RNA提取和RT-qPCR：从患者冰冻组织中提取总RNA，逆转录合成cDNA，通过PCR扩增和Sanger测序确认ARPP21 p.P529L变异在多种脑区的稳定表达。（4）细胞学研究方面，合成了五种GFP标记的ARPP21 cDNA构建体（ARPP21^WT、ARPP21^Q527R、ARPP21^P529L、ARPP21^P529L_S787P和ARPP21^P713L），转染人胚胎肾HEK293细胞和小鼠运动神经元样NSC-34细胞；使用亚砷酸钠诱导应激颗粒形成；通过免疫荧光、共聚焦成像和ImageJ定量分析评估蛋白聚集、与p62和G3BP1的共定位；使用MTT实验评估线粒体代谢活性。（5）免疫印迹分析：分离NP40可溶性和不溶性蛋白组分，用抗GFP和抗ARPP21抗体进行Western blot检测，并通过磷酸酶处理评估蛋白磷酸化状态。（6）统计学分析采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后多重比较检验。

四、研究结果

遗传学分析：发现大型法国家系中的p.P529L/p.P563L变异。一个包含10例患病个体的常染色体显性遗传大型家系中，研究人员对4例患者和2例强制携带者进行WES，经变异筛选（Minor Allele Frequency < 0.00005且CADD评分 > 25）后，在ARPP21基因中鉴定出唯一共享候选变异c.1586C>T（p.Pro529Leu，p.P529L，对应NM_001385562.1转录本上的c.1688C>T，p.Pro563Leu，p.P563L），未发现任何已知罕见ALS相关基因（包括GLT8D1）的共享变异。该变异在5个独立法国家系和1例散发ALS病例中被检出。

在WES数据集中鉴定ARPP21变异。除p.P529L/p.P563L外，还发现了一个复发的第二个错义变异c.2138C>T（p.Pro713Leu，p.P713L，对应p.P747L），见于3个无亲缘关系的fALS家系。此外还鉴定出6个额外罕见变异（p.L34M、p.V219I、p.P469H、p.Q527R、p.A596T、p.V719I），其中p.A596T和p.Q527R在患者和对照中频率相似，被判定为可能良性。ACMG/AMP指南分类表明，p.P529L/p.P563L和p.P713L/p.P747L为可能致病性；p.L34M、p.V219I、p.P469H和p.V719I为意义未明变异。蛋白质二级结构预测显示，p.P529L和p.P713L变异可导致β-折叠向α-螺旋的转换，提示结构性改变。未发现任何截短变异。

大规模sALS队列筛查及基因频率。对650例额外sALS病例的Sanger测序发现了1例携带p.P529L/p.P563L变异者。综合统计显示，这两种变异共占法国人群家族性ALS的2.7%（8/300）和散发性ALS的0.1%（1/890），使ARPP21成为排除了四个主要ALS基因后最常见的罕见遗传原因。

家系分析显示低外显率和早期发病。单倍型分析未发现5个p.P529L家系或3个p.P713L家系之间存在共同大单倍型，但意外发现1例散发患者与1例fALS患者共享49厘摩的单倍型，提示该变异并非新发突变，且存在不完全外显。在fALS1和fALS2两个大家系中，多个无症状男女携带者或死于其他原因或在高龄仍无运动症状。基于29例个体的年龄依赖性外显率计算显示，50岁时约为45%，此后仅缓慢增加至约55%。临床数据显示，62%的患者为脊髓起病，最常见为上肢起病（38%），仅10%为延髓起病；34%的患者发病年龄早于45岁，平均病程约18个月，提示疾病进展迅速。所有患者均未出现额颞叶痴呆或锥体外系症状。

神经病理学分析显示典型的TDP-43相关ALS病理及ARPP21作为可能的神经元应激标志。对一例p.P529L携带者（fALS1.III.8）的尸检组织分析显示，运动皮层、海马和额中回存在TDP-43包涵体；脊髓中有大量运动神经元丢失，存在Cystatin C阳性的Bunina小体；TDP-43免疫染色显示核染色丢失，运动神经元中出现圆形和线样包涵体，且磷酸化TDP-43阳性；p62/SQSTM1染色显示少突胶质细胞中大量卷曲小体及运动神经元中颗粒状纤维性或大圆形沉积物。ARPP21免疫染色在脊髓中显示了多种神经元染色模式：包括运动神经元胞体周围的“corbel staining”、胞质内颗粒状沉积、前角和后角中的花环样神经毡阳性及“Waldeyer细胞”中的丝状沉积。双标免疫组化显示，ARPP21阳性结构与TDP-43和p62通常互斥，与磷酸化神经丝标记SMI310的共定位提示可能为突触末端结构。对17例额外ALS患者和6例对照的脊髓比较分析发现，颗粒状胞质染色（2/18例ALS）和“corbel staining”（6/18例ALS）仅在ALS中出现而对照中缺如，但丝状包涵体在ALS（8/18例）和对照（1/6例）中均有发现，花环样神经毡阳性在所有病例和对照中均存在。海马中，ARPP21抗体可标记阿尔茨海默病病例中的颗粒空泡变性（granulovacuolar degeneration, GVD）结构。由此得出结论，ARPP21阳性沉积物并非p.P529L突变特异性病理，可能反映神经元应激状态。

细胞模型分析显示ARPP21^P713L突变体形成大包涵体并过度磷酸化。在HEK293细胞中表达GFP-ARPP21构建体后，所有构建体的转染率相似。在亚砷酸盐诱导应激颗粒（stress granule, SG）形成的条件下，各构建体与G3BP1的共定位水平相似。然而，ARPP21^P713L突变体在无应激条件下即显示出大量致密浓缩物和聚集的GFP沉积物，且这些沉积物与p62/SQSTM1高度共定位，提示涉及自噬/溶酶体途径。MTT实验显示，表达ARPP21^P713L的细胞代谢活性较野生型降低约20%。免疫印迹分析显示，ARPP21^P713L在NP40不溶性组分中积累了大量高分子量条带，这些条带在磷酸酶处理后消失，表明其对应过度磷酸化的ARPP21形式。在运动神经元样NSC-34细胞中，ARPP21^P713L同样表现出p62阳性的胞质大包涵体。相比之下，p.P529L突变体在两种细胞系中均未表现出明显的聚集表型，添加p.S787P变异亦未加重p.P529L的细胞表型。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究的核心发现是ARPP21 p.P529L/p.P563L和p.P713L/p.P747L变异在法国人群中是排除四个主要ALS基因后最常见的家族性ALS罕见遗传原因。这一结果在独立队列中复现了近期大规模负荷分析研究的结论。此前中国和澳大利亚队列未能显示ARPP21罕见变异的显著富集，提示该基因变异可能存在人群特异性或研究队列的异质性。

关于p.P529L/p.P563L变异的不完全外显率，研究人员提出了两种假说：一是ARPP21基因内含子17含有miR128-2，可调控其宿主转录本的表达，该调控机制可能组织特异性或涉及基因表达嵌合，从而影响突变与野生型等位基因在运动神经元中的表达比例；二是其他基因变异的修饰作用。虽然在法国队列中未发现GLT8D1变异，但在部分家系成员中检出了GRN、OPTN、TAF15、TIA1等ALS/FTD相关基因变异，且fALS2和fALS3中存在p.S787P与p.P529L的顺式共传递，这提出了寡基因遗传或修饰遗传效应的可能性。但p.S787P在体外未改变p.P529L的磷酸化/溶解性表型，故其贡献仍不明确。

关于致病机制，研究人员强调无证据支持ARPP21功能缺失导致ALS。已报道的Arpp21敲除小鼠模型表现为焦虑样行为和动机缺陷，而非运动功能障碍；未见ALS样表型。ARPP21变异更可能通过功能获得机制产生毒性。研究中鉴定出的大多数变异位于蛋白质的朊病毒样结构域（prion-like domain，低复杂度结构域LCD）内。类似TIA1中脯氨酸被疏水氨基酸（如亮氨酸）替换可促进液-固相转变的理论，p.P713L的聚集倾向和过度磷酸化支持该突变通过磷酸化驱动的聚集导致毒性的假说。对于p.P529L，由于未观察到细胞聚集表型，且患者组织中TDP-43病理与ARPP21沉积的空间分布并不完全重叠，提示其他机制或伴侣蛋白可能参与其中。例如，ARPP21是钙调磷酸酶（calcineurin）的竞争性抑制剂，突变ARPP21可能影响钙调磷酸酶活性从而调节TDP-43磷酸化状态。此外，研究人员承认缺乏p.P713L相关患者的死后组织是该研究的局限性。

结论部分的核心观点是：研究结果支持p.P713L/p.P747L ARPP21变异的致病性，其机制涉及磷酸化增加和蛋白聚集；尽管p.P529L/p.P563L变异在细胞实验中未显示类似的改变，但遗传学和神经病理学证据进一步支持其在ALS中的致病作用，并与TDP-43蛋白病存在神经病理学关联。将ARPP21纳入家族性ALS的常规基因检测组合可提升诊断性能，同时该基因所致ALS的临床特征及不完全外显率的观察为临床遗传咨询提供了重要的参考信息。