《Journal of Plant Growth Regulation》：Stress-Responsive Metabolome Remodeling in Cynara cardunculus Calli
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摘要
栽培刺苞菜蓟（Cynara cardunculus L. var. altilis）是菊科（Asteraceae）的一种地中海粮食作物，对环境胁迫具有良好的适应性。在本研究中，研究人员旨在通过降低植物复杂性并采用栽培细胞培养物作为模型系统，揭示生化适应的
摘要
栽培刺苞菜蓟（Cynara cardunculus L. var. altilis）是菊科（Asteraceae）的一种地中海粮食作物，对环境胁迫具有良好的适应性。在本研究中，研究人员旨在通过降低植物复杂性并采用栽培细胞培养物作为模型系统，揭示生化适应的特征。研究人员将刺苞菜蓟愈伤组织暴露于低温和盐胁迫下。结果表明，在两种胁迫条件下，脯氨酸均显著积累，且脯氨酸生物合成中的关键基因吡咯啉-5-羧酸合酶（P5CS）和吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR）表达上调。氧化损伤仅在高剂量和长期盐胁迫下表现明显，表现为H2O2水平升高。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的酶学分析揭示了胁迫响应中初级代谢与特化代谢交叉处的代谢重编程。GC-TOF-MS分析鉴定出434种胁迫下的差异积累代谢物（DAMs），包括有机酸、氨基酸、糖类、醇类和酚类化合物。较高的代谢重排伴随着渗透保护物质水平的升高，如有机酸（例如半乳糖二酸和半乳糖酸）和氨基酸（例如脯氨酸、苯丙氨酸、高丝氨酸和天冬氨酸）。最后，研究人员聚焦于胁迫诱导的刺苞菜蓟愈伤组织代谢重编程如何支撑生长-防御权衡并促进胁迫恢复力，对研究结果进行了讨论。
论文解读：刺苞菜蓟愈伤组织在低温和盐胁迫下的代谢组重塑机制
一、研究背景与科学问题
全球变暖日益导致不利的环境条件，温度骤变、干旱和高盐度胁迫严重制约作物生长并降低产量。高度驯化的作物通常对环境胁迫更为敏感，早期育种工作优先考虑产量而很少以非生物胁迫耐受性为目标，导致其遗传基础狭窄，促使育种家转向野生近缘种寻找优良性状供体。栽培刺苞菜蓟（Cynara cardunculus var. altilis）与洋蓟（C. cardunculus var. scolymus）均源自野生祖先野刺苞菜蓟（Cynara cardunculus var. sylvestris），原产于地中海盆地。与洋蓟相比，刺苞菜蓟经历了较低的驯化压力，保留了多种 rustic 特性，对干旱、盐度、渗透胁迫和重金属污染等多种非生物胁迫表现出耐受性，并越来越多地被用作适合边缘环境栽培的生物质作物。研究人员前期已建立栽培刺苞菜蓟细胞系作为新型生物质材料生产平台，发现低温和盐胁迫作为诱导子可显著提高酚类化合物积累，且对细胞生长影响极小，提示存在支撑胁迫适应的代谢转换，即特化代谢增强而初级生长得以维持。然而，刺苞菜蓟细胞如何动态调整代谢组以平衡生长与耐受之间的能量权衡尚不清楚，亟需在细胞水平上深入解析其胁迫响应机制。
二、研究目的
本研究利用刺苞菜蓟愈伤组织作为模型系统，该体系具有高度均一和稳定的行为特征，旨在通过整合生物化学与代谢组学方法，探究低温和盐胁迫下细胞初级代谢的变化，监测胁迫感知与信号传导的标志物——脯氨酸积累（代谢和转录水平）以及H?O?水平（氧化胁迫标志），通过测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）活性评估生长与防御之间的平衡，并利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术探索极性代谢组的变化，以揭示胁迫诱导的代谢重编程如何支撑生长-防御权衡并促进胁迫恢复力。
三、主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法：以“Spagnolo”基因型刺苞菜蓟幼叶片段诱导愈伤组织，在含Gamborg B5培养基、30 g L?1蔗糖、0.2 g L?1酪蛋白胨、0.2 mg L?1 6-苄氨基嘌呤（BAP）和1.3 mg L?1 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的培养基上于24°C黑暗、相对湿度60%条件下培养，每30天继代一次。独立愈伤组织培养批次作为生物学重复（n=9），每批含5个愈伤组织重复。低温胁迫处理为6°C下培养7天和14天，盐胁迫处理为0、50、100、150 mM NaCl下培养14天和28天，测定相对生长速率（RGR）。脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定，H?O?含量按Velikova等的方法测定。总RNA提取采用RNeasy试剂盒，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测P5CS和P5CR基因表达，以三个内参基因的几何均数进行标准化，采用ΔΔCT法计算表达变化。G6PDH活性通过监测340 nm处NADP?还原速率测定。代谢组学分析采用甲基叔丁基醚：甲醇（MTBE:MeOH，3:1）提取极性代谢物，经甲氧胺盐酸盐和N-三甲基硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（MSTFA）衍生化后，使用LECO Pegasus BT飞行时间质谱仪耦联Agilent 8890气相色谱仪进行GC-TOF-MS分析，代谢物鉴定结合质谱匹配和保留指数验证，数据经总和归一化、对数转换和Pareto标度化后，采用单变量分析（t检验、方差分析）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、变量重要性投影（VIP）分析和通路拓扑分析（MetPa）进行统计分析。
四、研究结果
（一）低温与盐胁迫下刺苞菜蓟愈伤组织的生长权衡
研究人员在代谢和生化分析前重新检测了低温和盐胁迫对愈伤组织生长的影响。低温胁迫持续抑制愈伤组织生长。盐胁迫下，100–150 mM NaCl浓度均表现出抑制生长效应，且与处理时长无关；而50 mM NaCl在14天时促进生长，较对照增加六倍，但28天时各浓度均出现生长下降。盐胁迫呈现浓度依赖性效应：低盐短期促进生长，高盐则无论时长均抑制生长。
（二）胁迫条件下脯氨酸积累与生物合成基因表达
低温胁迫下，脯氨酸水平在7天时显著升高，14天时持续增加，胁迫愈伤组织脯氨酸浓度约为对照的1.5倍。盐胁迫28天后，脯氨酸积累呈剂量依赖性增加，150 mM NaCl处理组脯氨酸水平为对照的3倍。P5CS和P5CR基因表达与脯氨酸积累一致：低温胁迫下P5CS在7天上升、14天达4倍峰值，P5CR在两个时间点均显著升高；盐胁迫下两个基因的表达随NaCl浓度升高而增加，P5CR对盐浓度尤为敏感，浓度超过50 mM时延长暴露使P5CR转录本增加2.5倍以上。P5CR作为协同调节的速率支撑组分，在长时间或高强度胁迫下维持脯氨酸持续积累。
（三）氧化胁迫响应：H?O?积累
低温胁迫未导致H?O?显著积累，两个时间点浓度均与对照相当（0.10–0.13 μmol g?1 FW）。盐胁迫下，仅在高盐浓度且暴露28天后H?O?达到最大值0.15 μmol g?1 FW，表明氧化胁迫与盐浓度和处理时长密切相关。
（四）G6PDH活性反映生长与防御的代谢优先性
低温胁迫7天时G6PDH活性显著高于对照，14天时无显著差异。盐胁迫下，100 mM NaCl处理14天时G6PDH活性升高2倍；28天时50 mM和100 mM NaCl处理组活性均较对照下降，100 mM时降低约3.5倍。G6PDH活性变化反映了磷酸戊糖途径（PPP）在不同胁迫阶段提供还原力（NADPH）的动态调节。
（五）低温胁迫下的差异代谢响应
GC-MS分析显示，低温7天后，半乳糖二酸、腺嘌呤、吡哆醛、半乳糖胺、2-氨基己二酸、己二酸-2,6-内酰胺、二氢玉米素核苷和亚氨基二乙酸显著积累，天冬酰胺和谷氨酰胺显著降低。低温14天后代谢变化更加显著，葡庚糖酸、糖精、苯丙酮酸、丙二酸、亚精胺和半乳糖二酸为积累最显著的代谢物（FC>10），而马来酰胺酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、丙酮酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、富马酸、苏糖酸和甘油酸显著下降。PLS-DA分析显示胁迫与对照样品在7天和14天均清晰分离。7天时腺嘌呤具有最高VIP得分，吡哆醛、半乳糖二酸、亚氨基二乙酸、半乳糖胺、腐胺及较低程度的赤藓糖和N-乙酰氨基葡萄糖也显著积累，氨基酸代谢中谷氨酰胺、天冬酰胺和焦谷氨酸降低。14天时葡庚糖酸和苯丙酮酸为最显著的判别代谢物（VIP>2.6），苯丙氨酸（VIP>1.6）积累提示莽草酸途径激活，亚精胺（VIP>2.4）确认为胁迫诱导代谢重编程的标志物。天冬氨酸升高、多胺（尤其亚精胺）增加，而谷氨酰胺、马来酰胺酸、高丝氨酸和草酰乙酸随胁迫时间持续下降。通路分析确认低温胁迫影响氨基酸代谢，特别是精氨酸和脯氨酸代谢通路，且呈时间非依赖方式；延长胁迫还改变丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。
（六）盐胁迫下的差异代谢响应
PLS-DA得分图显示，14天和28天各盐浓度处理与对照均明显分离，处理样品沿成分1呈浓度依赖性分布。14天时，半胱氨酸和高半胱氨酸（VIP>2.6）随盐浓度逐渐升高，而β-丙氨酰组氨酸、胱硫醚、烟酸、天冬酰胺、羟基脲、丙二酸和富马酸则呈相反趋势。28天时几乎所有检测化合物均普遍减少，β-丙氨酰组氨酸、半乳糖二酸和乳酸在高浓度下降低（VIP>2），羟基脲随盐浓度升高成比例降低（VIP>2.6），丙二酸在低温和盐胁迫延长时均积累，脯氨酸是唯一在高盐浓度下增加的氨基酸。热图聚类分析表明14天时不同类型代谢物存在不同的上/下调趋势，28天时则出现代谢物积累的主要筛选。通路分析显示，无论暴露时间，丙酮酸代谢等能量相关通路均持续受影响，28天盐暴露还改变酪氨酸代谢。
五、讨论与结论
研究表明，刺苞菜蓟细胞对低温和盐胁迫的代谢响应表现为初级代谢的明显重组，从以碳和能量为中心转向靶向产生含氮代谢物、渗透保护物质和支持膜稳定的分子，符合植物中常见的生长-防御权衡概念。由于培养体系始终补充蔗糖且缺乏功能性叶绿体，这些细胞可视为库组织，类似于根部。胁迫下细胞生长的普遍降低可视为生长抑制的主动分子机制，是资源重分配至生存和防御的适应性策略，其中活性氧（ROS）在调控生长与防御信号中发挥重要作用，但ROS过量产生会造成膜脂和细胞器损伤。
低温胁迫下，脯氨酸积累和生物合成增强足以限制H?O?积累，在低温下维持氧化还原平衡。G6PDH活性在低温7天时升高，与耐冷物种的酶学特征一致。PPP途径的激活可能提供足够代谢通量维持脯氨酸生物合成，同时向其他抗氧化系统输送NADPH。低温7天的代谢特征以防御相关响应为主，包括腺嘌呤、吡哆醛、腐胺、赤霉酸A4和半乳糖二酸积累，而生长促进型氨基酸谷氨酰胺和天冬酰胺降低，表明代谢从增殖转向防御和生存。延长低温胁迫时草酰乙酸降低提示TCA衍生碳转向天冬氨酸生物合成，高丝氨酸降低反映甲硫氨酸和SAM合成通量受限，亚精胺积累支持多胺介导的胁迫保护，苯丙氨酸和半乳糖二酸积累表明氧化防御增强。总体而言，低温胁迫下刺苞菜蓟愈伤组织发生从生长向胁迫适应的代谢转变。
盐胁迫引发比低温更广泛复杂的代谢调整。50 mM NaCl浓度下，愈伤组织表现出随时间推移的稳态适应，脯氨酸和H?O?水平无显著变化，内源吲哚-3-乙酸（IAA）水平降低提示其被主动消耗以支持生长，这可能反映愈伤组织执行类似根系的发育程序，在代谢资源转向胁迫耐受前进行短暂的生理适应。100 mM NaCl暴露14天时，G6PDH活性显著升高，触发NADPH产生以维持抗氧化防御系统，谷氨酰胺水平降低表明PPP诱导的代谢集中于向渗透保护物质（腐胺和脯氨酸）的生产。150 mM NaCl处理28天时H?O?过度积累，氧化胁迫不再有效控制。半胱氨酸、高半胱氨酸和甲硫氨酸及其衍生物显著减少，可能损害谷胱甘肽生物合成，削弱氧化还原缓冲能力。由于培养条件为暗处非光合生长，光系统来源的ROS可排除为主要贡献者，线粒体呼吸和质膜相关RBOH-NADPH氧化酶系统可能是该阶段ROS的主要来源。150 mM NaCl下G6PDH活性未充分升高，无法同时满足脯氨酸合成和抗氧化防御的NADPH需求，表明存在代谢瓶颈，生长停滞与氧化胁迫上升同时发生。
综上所述，该研究证明刺苞菜蓟愈伤组织中胁迫诱导的中心代谢重编程依赖PPP活性和NADPH可用性。生长-防御权衡是一个主动调控的过程，氧化还原平衡在细胞抵御非生物胁迫中起决定性作用。该研究为深入理解非光合组织如何重定向代谢流作为适应性策略提供了基础，促进了对刺苞菜蓟及植物整体胁迫恢复力的理解。研究成果发表在《Journal of Plant Growth Regulation》。
