《Discover Neuroscience》：TDP-43 overexpression induces cellular dysfunction and ALS-associated transcriptional changes
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反式激活反应DNA结合蛋白（TDP-43）在多种神经退行性疾病中发挥关键病理作用，尤其是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）。尽管TDP-43在神经退行性疾病中的作用已明确，但其研究仍是一个复杂领域，因为目前尚不清楚是核内功能缺失、胞质内毒性功能获
反式激活反应DNA结合蛋白（TDP-43）在多种神经退行性疾病中发挥关键病理作用，尤其是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）。尽管TDP-43在神经退行性疾病中的作用已明确，但其研究仍是一个复杂领域，因为目前尚不清楚是核内功能缺失、胞质内毒性功能获得还是两者共同驱动发病机制。TDP-43过表达模型是开发靶向TDP-43药物候选物时的有利工具，然而现有模型往往缺乏以患者数据集为基准的全面RNA测序（RNA-seq）数据。鉴于TDP-43过表达作为ALS相关病理模型的价值，研究人员在HEK293来源细胞系中开发了一种稳定、可诱导的系统，为研究TDP-43失调提供了一个实用且可扩展的平台。利用该系统，研究人员发现TDP-43过表达反映了与ALS病理相关的关键特征，引起细胞毒性、核质错误定位以及广泛的转录组变化。此外，在该模型与ALS患者来源数据之间进行的比较性RNA-seq分析揭示了显著的重叠，TDP-43过表达细胞系中64%的差异表达基因在ALS患者组织中也发生改变，支持该模型的疾病相关性。分析中识别出的目标基因包括NUP85、SREBF2、VAMP5、WDR41、CDC23、DKC1和PTS。这种稳定、可诱导的TDP-43过表达模型及其相关的转录组数据集为ALS和其他TDP-43蛋白病研究提供了一个多功能平台，能够研究TDP-43功能障碍的分子驱动因素、识别潜在的疾病相关药理学靶点，并评估旨在减轻TDP-43驱动的细胞毒性或恢复正常TDP-43定位的治疗候选药物。
反式激活反应DNA结合蛋白（TDP-43）是多种神经退行性疾病的关键病理蛋白，尤其在肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）中，超过90%的ALS病例呈现TDP-43从细胞核向细胞质的错误定位，并形成泛素阳性聚集体。然而，疾病发病是由核内功能缺失、胞质毒性功能获得还是两者共同驱动仍不清楚。TDP-43过表达模型有助于开发靶向药物，但现有模型常缺乏与患者数据集基准比较的全面转录组数据。因此，研究人员开发了一种稳定、可诱导的TDP-43过表达细胞系，并系统分析其转录组特征及与ALS患者数据的一致性。该研究发表在《Discover Neuroscience》。
研究人员利用Flp-In? T-REx? 293系统在HEK293细胞中构建了四环素诱导的全长TDP-43稳定过表达细胞系（HEK293-TDP）及空载体对照（HEK293-EV）；通过Western blot检测蛋白水平及核质分布，使用MTS法评估细胞毒性；对诱导0、24、48小时的细胞进行RNA-seq，采用STAR比对、DESeq2分析差异表达基因，GeneSCF进行基因本体（GO）富集分析，SpliceSeq分析选择性剪接；同时分析NYGC ALS联盟（GSE153960）中1579例患者样本（10种组织类型）的差异表达基因并与细胞模型比较；最后用qRT-PCR验证候选基因的表达与剪接变化。
3.1 TDP-43过表达导致病理表型
四环素诱导24–48小时后，HEK293-TDP细胞中TDP-43蛋白水平显著升高（24小时2.1倍，48小时3.1倍），细胞质/核比值增加（24小时1.5倍，48小时2.4倍），MTS检测显示48小时细胞毒性增加26.9%，而对照细胞无显著变化。
3.2 TDP-43过表达诱导广泛的基因表达变化
RNA-seq分析显示，24小时时共鉴定出949个差异表达基因（DEGs），其中433个上调、516个下调；48小时时增至2286个DEGs，呈现时间依赖性增加。研究以24小时时间点为重点以捕捉早期直接变化。
3.3 RNA测序揭示TDP-43驱动的广泛基因本体变化
GO分析显示，24小时富集97个GO条目，48小时富集129个，其中56个共有。最显著富集的通路包括神经系统发育、化学突触传递、生物发育和细胞黏附，与TDP-43已知功能一致。
3.4 RNA测序鉴定出TDP-43驱动的大量选择性剪接
SpliceSeq分析发现24小时存在664个显著剪接事件（涉及608个基因），48小时为1537个（涉及1329个基因）。其中PTS、SAFB、TBC1D1发生外显子跳跃，可能导致截短或功能异常的蛋白。
3.5 TDP-43过表达反映ALS转录组特征
与NYGC ALS联盟患者数据比较显示，该细胞模型中64%（610/949）的DEGs在至少一种ALS患者组织中也差异表达。焦点基因NUP85、SREBF2、VAMP5、WDR41、CDC23、DKC1、PTS在患者不同组织中出现显著改变，支持模型与人类疾病的转录组一致性。
3.6 qPCR验证RNA测序结果
qRT-PCR确认CDC23、DKC1、ELP1、NCAPD3、NUP85、NUP88、RBM12、SREBF2、WDR41下调，VAMP5上调，PTS、SAFB、TBC1D1的剪接变异与RNA-seq结果一致，验证了数据的可靠性。
讨论部分指出，该模型无蛋白标签，可避免标签引起的定位假象，且四环素浓度可调，适合筛选治疗药物。转录组变化广泛且随时间增加，与患者数据的重叠验证了模型的相关性。候选基因中，NUP85参与核孔复合体，其下调与TDP-43病理相关；SREBF2为胆固醇代谢调节因子，在细胞模型和患者组织中均下调；VAMP5、WDR41、CDC23、DKC1的异常改变在ALS中具有文献支持；PTS为新型候选基因，其异常剪接可能导致酶活性丧失。未来研究需在神经元模型中验证，并与TDP-43敲低模型比较，以全面理解机制。
结论：这种用户友好、可诱导的全长TDP-43过表达模型是ALS研究的多功能工具。它不仅能用于测试旨在减少TDP-43驱动的细胞毒性或恢复其定位的新型疗法，其相关转录组数据也为识别ALS药物发现研究的新靶点提供了宝贵资源。HEK293-TDP细胞系与ALS患者数据之间转录组的一致性增强了该模型的实用性。尽管神经元模型被认为更适合ALS和TDP-43研究，但HEK293-TDP细胞具有易用性、可规模化和灵活性等优势，其DEGs中64%在ALS患者组织中发生改变。该研究提供了可靠、可适应的TDP-43功能获得模型和全面的RNA-seq数据，为未来TDP-43蛋白病研究和ALS研究进展提供了重要潜力。
