综述：骨骼肌兴奋-收缩偶联的基本要素

《European Journal of Applied Physiology》：The nuts and bolts of excitation–contraction coupling in skeletal muscle

　　

人类和所有动物的运动依赖于一系列基本步骤的协调进行，这些步骤将肌纤维表面膜上的电动作电位与细胞质中Ca²⁺浓度的升高联系起来，后者激活收缩蛋白。兴奋-收缩（EC）偶联是将电信号转化为从细胞内Ca²⁺储存库中大量释放Ca²⁺的过程。研究人员探讨了我们对骨骼肌EC偶联所依赖的结构和蛋白质知识的演变、尚未解答的问题以及未来将揭示偶联过程基本分子事件的发展。通过未来发展获得的更深理解将揭示与EC偶联蛋白突变相关的、或由疲劳和衰老导致的肌肉无力的分子基础。这些益处将有助于合理设计疗法，以增强在许多情况下与EC偶联改变相关的肌肉力量。

引言
兴奋-收缩偶联（EC coupling）是动作电位信号控制肌肉收缩的关键步骤，该信号通常由中枢神经系统（CNS）启动。在骨骼肌中，这一过程依赖于跨越表面膜与细胞内膜系统之间连接的四种蛋白质之间的紧密物理相互作用，即CaV1.1及其β1a亚基、STAC3和RyR1。骨骼肌的一个特征是，收缩力受细胞内多种因素精细调节，这些因素可直接或间接地通过影响支撑EC偶联的蛋白质功能来作用于收缩蛋白。总体而言，Ca²⁺稳态反映了肌浆网（SR）释放的Ca²⁺量与肌纤维代谢能力以及动物代谢和精神状态的整合。SR的Ca²⁺释放取决于胞质中多种可溶性因子的浓度，包括Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、ATP、H⁺和无机磷酸盐，这些因子均受运动及肌肉疲劳等因素影响。这些因子直接调节EC偶联过程中CaV1.1和RyR1的开放。肌肉力量和运动能力可因RyR1、CaV1.1、β1a或STAC3的先天性肌病而严重降低，此外，EC偶联的改变也导致衰老过程中的肌肉无力。理解EC偶联的分子过程将有助于合理设计药物，以减轻EC偶联的有害改变，而这一理解将关键依赖于对支撑EC偶联的蛋白质高分辨率结构及相关机制的认知。心脏中的EC偶联与骨骼肌有本质区别，心脏偶联依赖Ca²⁺从心肌CaV1.2扩散至RyR2，而骨骼肌则依赖机械耦合。本文聚焦于骨骼肌中机械性EC偶联的独特挑战。

对EC偶联机制理解的演变（The evolution of our present understanding the EC coupling mechanism）
对EC偶联本质的探究可追溯至1949年Hill的预言，即肌纤维内必定存在动作电位传导通路，以解释骨骼肌在动作电位刺激后迅速收缩的现象。20世纪60年代，电子显微镜观察发现横管（T-tubule）与SR之间的三联体连接是信号转导的潜在位点。最初认为偶联依赖于离子或可溶性递质在连接间隙中的扩散，但1973年Schneider和Chandler的实验证据表明该偶联是机械性或物理性的，而非扩散性。此后，分子组分的鉴定首先集中于两种膜结合离子通道蛋白：SR膜上的Ca²⁺释放通道被确认为巨大的2.4 MDa RyR1，随后T-tubule膜上的电压传感器被鉴定为CaV1.1（当时称为二氢吡啶受体，DHPR）。仅凭这些蛋白质不能解释骨骼肌EC偶联的全部特征，因此开始了对偶联蛋白的搜寻。此后，CaV1.1的可溶性β亚基（β1a）和STAC3被发现是三联体连接信号传递的额外必需组分。进一步研究确定，表达CaV1.1、β1a、STAC3、RyR1和junctophilin 2五种蛋白质是在肌肉来源细胞系中重建机械偶联的最小需求。其中，junctophilin主要起结构作用，跨越CaV1.1与RyR1之间的连接间隙并维持连接的几何结构，使其他EC偶联组分能够适当相互作用以传递信号。β1a和STAC3还承担辅助蛋白翻译后运输至正确细胞位置的功能。这四种核心蛋白统称为“核心EC偶联蛋白”。

哺乳动物骨骼肌纤维和肌肉来源细胞系三联体连接中EC偶联机器的亚细胞定位和排列（Subcellular location and arrangement of the EC coupling machinery in the triad junction of mammalian skeletal muscle fibres and muscle-derived cell lines）
T-tubule是肌纤维表面膜的微小内陷，主要源于表面膜的小窝，其横跨肌纤维整个横截面，并与SR终池形成三联体连接。T-tubule和三联体连接与肌丝排列严格对齐，在鱼类肌纤维中位于Z线，在哺乳动物肌纤维中位于A带与I带交界处。相邻肌节T-tubule之间的纵向延伸同时被描述，后来发现这些纵向小管在肌纤维内纵向传导动作电位以及绕过相邻肌节中起重要作用。值得注意的是，三联体连接的结构和尺寸（包括T-tubule膜、连接间隙和SR膜）在多种健康骨骼肌纤维中是一致的，尽管不同物种、肌肉类型和纤维类型之间的收缩速度及T-tubule/SR几何结构有显著差异。连接间隙的宽度约9-10 nm，与两侧膜宽度相近。膜间恒定间距表明连接内蛋白质的排列对正常EC偶联至关重要。事实上，必需蛋白的缺失或修饰总是导致显著的EC偶联改变。自20世纪40年代末以来，骨骼肌EC偶联所需的四种核心蛋白已被鉴定，其功能和结构特征得到了广泛研究。允许蛋白质在传递偶联信号过程中相互作用的结合位点已被确定，核心蛋白的高分辨率结构也已获得。未来挑战将集中于理解传递EC偶联信号至SR以释放激活收缩蛋白所需Ca²⁺的蛋白质内部及蛋白质之间的基本分子变化。

必需蛋白——骨骼肌EC偶联的要素（Essential proteins – the nuts and bolts of skeletal EC coupling）
尽管四种核心EC偶联蛋白足以在肌肉来源细胞系中重建机械偶联，但许多其他可溶性和膜结合蛋白有助于维持连接结构并调节偶联过程。机械模型强调了核心蛋白在连接间隙内的相互连接排列以及蛋白之间的多重潜在相互作用。该模型基于Ca²⁺释放通道的同源四聚体结构，反映了蛋白复合物可能存在的四重对称性。已经确定每隔一个RyR1通道与四个CaV1.1分子偶联，而未偶联的RyR1通道之间呈交替排列。每个偶联RyR1四聚体与四个CaV1.1分子相关，这些分子在冻裂复型中形成颗粒簇，称为四联体（tetrad）。四联体结构的尺寸与RyR1四聚体相似，且对正常EC偶联至关重要；核心EC偶联蛋白中影响正常骨骼肌EC偶联的突变都会破坏四联体结构。心肌细胞中未见四联体颗粒排列，这与心肌EC偶联仅依赖Ca²⁺从CaV1.2扩散至RyR2一致。骨骼肌EC偶联对四联体结构的依赖性由许多证据表明，例如CaV1.1 II-III环缺失或β1a、STAC3缺失均破坏骨骼肌EC偶联和四联体形成。这些观察，加上缺乏CaV1.1与RyR1直接结合的明确证据，强烈支持了通过必需胞质蛋白实现膜蛋白间物理偶联的概念。在三联体复合物中，CaV1.1电压传感器蛋白的数量约为RyR1四聚体离子通道的两倍。对于偶联的RyR1通道，每个RyR1四聚体对应四个CaV1.1；若将连接阵列中偶联和未偶联的RyR1四聚体都计算在内，则比例为2:1。每个α1 CaV1.1分子可能伴有一个β1a亚基和一个STAC3分子，但确切数目未知，且分子间可能存在瞬时相互作用。关于三联体连接中约一半RyR1四聚体未与CaV1.1四联体偶联的问题，未偶联通道在EC偶联过程中如何被激活仍待解答。Ca²⁺通过偶联RyR释放后激活未偶联通道的可能性未被排除，另一种可行机制是与CaV1.1偶联的RyR1通道进行物理通讯。潜在的相互作用位点已被识别，同时脂双层中RyR1通道的“偶联门控”现象（两个或更多通道同时开放）也为物理偶联提供了证据。

肌浆网连接面膜上的Ca²⁺释放通道（The Ca²⁺ release channel in the junctional face membrane of sarcoplasmic reticulum）
RyR1通道位于SR膜中形成三联体连接胞内边界的“连接面膜”上，呈类晶格状排列。由于EC偶联过程对除草剂ryanodine敏感，20世纪80年代便认为某种形式的“ryanodine受体”参与EC偶联。1989年，高分子量RyR1蛋白被克隆和测序。随后鉴定出三种RyR亚型：RyR1主要表达于骨骼肌，RyR2主要表达于心脏和脑，RyR3最初发现于脑但后来发现于许多其他组织。RyR1确为骨骼肌Ca²⁺释放通道的决定性证据来自20世纪90年代初，RyR1敲除后EC偶联消失，而在RyR1缺失的肌细胞或肌管中表达重组RyR1后可恢复EC偶联。单个RyR1离子通道的开放特性已在多种分离制备物中广泛研究。结构研究方面，最早在骨骼肌薄切片电镜图中可清晰看到RyR1蛋白。在三联体连接内，RyR1通道形成电子致密物质阵列或“连接脚”，跨越T-tubule与SR膜之间的间隙。旋转投影显示每个“脚”具有规则的四重结构，随后该足蛋白被鉴定为同源四聚体RyR1 Ca²⁺释放通道。RyR1离子通道四聚体的尺寸给高分辨率结构测定带来了巨大挑战。早期约30 ?分辨率的冷冻电镜结构证实了四个RyR1单体形成整体蘑菇形状，其“帽”位于T-tubule/SR连接处的细胞质中，“茎”跨越SR膜，一个小结构域伸入SR腔。随后数十年间，冷冻电镜分辨率逐步提高至约10 ?，从而能够定位与通道开放和关闭相关的明确结构域中的构象变化。近年来分辨率进一步提高至3.6-6.2 ?，最近在一些高度结构化区域接近约3.0 ?的原子分辨率。X射线晶体学和核磁共振（NMR）方法提供了互补的结构信息。冷冻电镜技术现已发展到可以比较RyR1四聚体在开放和关闭状态下的结构，追踪蛋白质内残基取向的变化，从而回答巨大RyR1分子胞质末端的结合位点如何影响远在数十埃之外的SR膜内离子通道开放这一长期问题。

连接T-tubule膜的电压传感器（The voltage sensor in the junctional T-tubule membrane）
20世纪60年代末至70年代初，关于感受T-tubule膜电压变化的分子是否为蛋白质以及电压传感的分子机制存在广泛争论。当时一个关键发现是电压钳电生理记录到的微小信号，称为“电荷移动”，被认为反映了膜上电压传感蛋白跨膜部分中偶极子的移动，从而启动电压敏感性事件如离子电流或EC偶联。电荷移动与EC偶联电压依赖性之间的相关性，以及EC偶联对硝苯地平的敏感性，提供了有力证据表明该电压传感分子是CaV1.1（当时称为DHPR或L型Ca²⁺通道）。20世纪90年代，重组CaV1.1在CaV1.1缺失的肌管中表达可恢复EC偶联，最终确认了电压传感器的分子身份。此后40年间，大量研究利用电压钳电生理学、分子生物学和定点突变技术，鉴定了CaV1.1中EC偶联所必需的特定残基，并区分了感受电压启动EC偶联的残基与开启离子通道孔的残基。结构上，CaV1.1是典型的电压门控阳离子通道，由四个跨膜结构域或重复序列构成，各结构域之间通过胞质环相连，四个跨膜结构域围绕中心Ca²⁺离子通道孔。每个跨膜结构域含有四个跨膜螺旋，其中每个结构域的第四个（S4）螺旋含有带电残基，可随膜内电场变化而移动并产生“电荷移动”。一个重要问题是单个电压传感结构域控制离子通道电流而另一个结构域启动EC偶联，还是同一结构域同时调节两个过程。最近证据表明，电压传感结构域III专一控制骨骼肌EC偶联。随后冷冻电镜分析揭示了CaV1.1与β1a、α2δ-1和γ亚基结合的精巧结构细节。有趣的是，冷冻电镜数据得到两类结构，其中一类显示β1a与CaV1.1相邻元件存在显著位移。该位移是否构成EC偶联机制的一部分，以及哪些胞质环包含结合其他蛋白质并可能构成跨连接EC偶联通路的序列，是亟待解决的问题。CaV1.1 II-III环的C区（残基720-765）对骨骼肌EC偶联至关重要，但全长CaV1.1的II-III环与全长RyR1的直接结合尚未得到证实，因此提示II-III环的相关相互作用可能通过中间蛋白发生。现已证明II-III环的不同区域与β1a亚基及STAC3结合，STAC3还结合CaV1.1 C末端的残基，提示核心蛋白之间可能存在多种结合相互作用共同参与EC偶联。

连接CaV1.1与RyR1的连接间隙内蛋白（Proteins within the junctional space that link CaV1.1 to the RyR1）
最初认为EC偶联依赖于从CaV1.1直接传递至RyR1的信号，但经过深入研究，显然需要一个或多个连接间隙内的胞质蛋白以某种方式与CaV1.1和RyR1相互作用以传递信号。这种巨大的大分子复合物将从T-tubule腔内的细胞外溶液延伸，穿过连接间隙，终止于SR腔。最先被探索的胞质蛋白之一是CaV1.1的β1a亚基。
β1a亚基在三联体形成和EC偶联中具有多重作用。它可引导CaV1.1定位至T-tubule膜并调节CaV1.1的离子通道功能，也被认为是机械性EC偶联的可能参与者。研究发现其C末端尾调节机械偶联，随后被确认为四种核心EC偶联蛋白之一。冻裂研究显示，β1a的C末端尾对DHPR四联体形成至关重要。值得注意的是，对应于β1a亚基近端C末端的肽段可直接结合RyR1，并调节EC偶联强度。最近报道的CaV1.1 II-III环与β1a亚基之间的相互作用影响EC偶联。β1a亚基还结合CaV1.1 I-II环上的α相互作用结构域（AID），而AID则与β1a高度保守的GK区域（靠近其C末端尾）中的疏水沟结合。AID仅覆盖β1a表面的一小部分，因此β1a的大部分表面仍可用于与其他CaV1.1区域或连接间隙内其他蛋白质相互作用。
STAC3是最后被鉴定的核心EC偶联蛋白，它是一种衔接蛋白，包含三个明确的结构域：位于N端部分的C1结构域，以及位于C端一半的SH3-1和SH3-2结构域。C1结构域和SH3结构域均以参与多种蛋白质-蛋白质相互作用而著称。STAC3的串联SH3结构域的三维结构已确定，C1的NMR结构也已存入PDB。STAC3作为衔接蛋白的完美结构使其能够参与EC偶联中的蛋白相互作用。STAC3首次被牵涉到骨骼肌EC偶联，是因为该蛋白的突变导致先天性美洲原住民肌病（NAM）。STAC3通过SH3-1结构域结合CaV1.1 II-III环，同时C1和连接区结合CaV