利用扫描探针显微镜揭示软体生物单个肌肉的循环依赖性力学行为

《Journal of Biomechanics》：Cycle-dependent mechanical behavior of individual muscles in soft-bodied organisms revealed by scanning probe microscopy

　　

摘要

软体生物为揭示运动学基本规律提供了肥沃土壤，然而由于其肌肉的脆弱性、顺应性和有限的实验可操作性，直接获取其微观肌肉的力学性能仍然难以实现。本文提出了一种基于扫描探针显微镜（SPM）的单轴原位拉伸实验框架，能够以高空间和力分辨率对果蝇幼虫单根肌肉进行直接的循环应力-拉伸测量。我们发现这些微观肌肉展现出独特的循环依赖力学响应，表现为J形非线性的演化、渐进式滞后调制以及在重复加载下的刚度适应性。值得注意的是，这些行为可以通过一个最小化的伪弹性模型进行定量描述，该模型将观测到的滞后演化与能量耗散以及肌节尺度的潜在结构适应联系起来。这些发现为理解软体生物运动的固有被动力学提供了新的见解，并为研究生物软组织力学行为建立了一个高分辨率实验框架。

引言

肌肉组织是一种主动软材料，能够将化学能转化为机械功，使生物系统产生力和大变形（Sakamoto and Murrell, 2024）。除了其主动收缩功能外，肌肉的固有被动力学特性对于力的传递和运动同样至关重要。尽管哺乳动物骨骼肌的力学行为已被广泛研究，但大多数研究集中于分层组织化的纤维状组织，且主要受临床和生理学考虑的驱动（Loumeaud et al., 2024）。这种复杂性往往掩盖了较小结构尺度上的基本力学原理。因此，尽管非哺乳动物生物中结构更简单的肌肉系统具有揭示结构-力学关系的潜力（Wiersma, 1952），但其本构行为仍然知之甚少。

软体生物，如果蝇幼虫（图1a），为研究相对简单的肌肉架构提供了可操作的研究系统（Montell, 2019）。其节段排列的肌肉通过与顺应性表皮的机械耦合产生蠕动式运动（Kohsaka et al., 2017, Liang et al., 2025, Montell, 2019）。果蝇幼虫体壁肌肉的结构组织和命名已被充分确立（Zarin et al., 2021）。在微观尺度上，果蝇幼虫肌肉与哺乳动物横纹肌存在本质差异（Taylor, 2006, Hardie and Hawes, 1982, Middleton et al., 2006）。这些肌肉含有排列整齐的微纤维，但缺乏哺乳动物骨骼肌那种广泛的层次化组织结构，这可能导致了不同的力学响应（Herrel et al., 2002）。

直接对单根幼虫肌肉进行拉伸测试仍面临技术挑战（Swank, 2012）。三龄（L3）幼虫的单个体壁肌肉通常长度达数百微米，宽度40–60 μm，厚度10–15 μm（图1b），产生的力难以使用常规力传感器进行测量。此外，其微小的尺寸和顺应性对标准微拉伸平台也构成了挑战（Booth et al., 2024）。尽管扫描探针显微镜（SPM）具有高力灵敏度和液体兼容性，但常规力模式由于位移范围有限和加载几何构型的限制，不适用于微米尺度生物组织（如单根果蝇幼虫肌肉）的单轴拉伸测试（Hang et al., 2011, Tan and Lim, 2006）。

本文提出了一种在SPM力-体积模式中实现的单轴拉伸测试方案（Olubowale et al., 2021），能够对单根果蝇幼虫肌肉进行循环单轴加载。通过调整探针-样品相互作用几何构型，该方法在重复加载循环中获取力-位移响应曲线，并利用独立测量的肌肉几何参数将其转化为应力-拉伸关系。我们表征了单根幼虫肌肉的被动循环力学行为，揭示了J形非线性、渐进式滞后调制和刚度适应性。虽然J形响应与许多生物组织的拉伸行为一致（Ehret et al., 2011, Granzier and Irving, 1995, Komatsu et al., 2004, Rivera et al., 2005），但顺序循环行为与大型蠕虫肌肉中观察到的预调理且可重复的滞后现象不同（Dorfmann et al., 2007, Dorfmann et al., 2008）。这种差异可能源于果蝇幼虫独特的几何形状和微观结构。由于幼虫肌肉的循环力学数据有限，现有本构模型（Ahamed et al., 2016, Dorfmann et al., 2008, Lin et al., 2009）无法直接描述所观测到的响应。因此，我们基于经典Fung框架（Fung et al., 1979）开发了一种改进的Fung型伪弹性模型，将测量的循环响应与肌节尺度的潜在结构适应联系起来。

章节摘要

基于SPM的单轴拉伸测试方法

在SPM标准力模式操作中，相互作用力是通过假设加载方向垂直于样品表面来从悬臂梁偏转推断的。然而，悬臂梁以有限倾角工作，因此沿悬臂梁轴方向的变形会引起可测量的偏转（Vazquez et al., 2025）。利用这一几何特性，我们采用PeakForce定量纳米力学（QNM）模式（Dokukin and Sokolov, 2012）实现了单轴拉伸加载，

单根肌肉的循环应力-拉伸测量

力-位移曲线可参见补充材料中的图S1。图5展示了一根代表性果蝇幼虫肌肉在7.5 μm/s拉伸速率下（对应扫描速率为0.0625 s?1）的顺序循环应力-拉伸响应。在同一根肌肉上进行了四个连续的加载-卸载循环，循环之间未更换或重新安装样品。第一个加载-卸载循环表现出明显的J形

讨论

基于循环响应和模型结果，我们提出了一种将循环依赖力学与肌肉中潜在分子演化联系起来的微观结构假说。这些响应可以通过Titin/Sls蛋白的构象演化来解释。在第1个循环中，具有显著足部区域的J形响应（Mitsuhashi et al., 2018, Pritchard et al., 2014）（$\lambda =1～1.1$）可能反映了Titin/Sls蛋白的卷曲-伸展构象转变。观测到的滞后现象可能

结论

我们开发了一个基于SPM的原位平台，能够对单根果蝇幼虫肌肉进行直接力学表征。该平台揭示了循环依赖的被动力学行为，并通过最小化伪弹性框架实现了对滞后、能量耗散以及肌节尺度潜在适应性的定量解释。本研究为研究微观生物材料的循环力学提供了一种通用方法。

CRediT作者贡献声明

孙耀：文章撰写–审稿与编辑，文章撰写–初稿撰写，可视化，方法论，调查研究，基金获取，正式分析，概念构思。邢一辰：文章撰写–初稿撰写，可视化，数据管理。何银辉：文章撰写–初稿撰写，方法论。周建友：文章撰写–审稿与编辑，方法论。龚哲峰：文章撰写–审稿与编辑，资源，项目管理，方法论，基金获取。朱平平：文章撰写–审稿与编辑，文章撰写–

利益冲突声明

作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到国家自然科学基金重大项目（编号：T2293720/T2293722）、国家自然科学基金（编号：12102113，12372077）、广东省基础与应用基础研究基金（编号：2024A1515010018）以及深圳市科技计划项目（编号：JCYJ20250604145422030）的资助。

孙耀|邢一辰|何银辉|周建友|龚哲峰|朱平平|钟正