基于热稳定性从绿色荧光蛋白融合重组蛋白中回收具有生物活性的片球菌素

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Thermal-stability-based recovery of biologically active pediocin from a recombinant protein fused to green fluorescent protein

　　

嗜热乳杆菌素由某些乳酸菌产生，对单核细胞增生李斯特菌具有高度的抗菌活性，因此有望被用作多肽食品防腐剂。本研究开发了一种从大肠杆菌表达的与绿色荧光蛋白（GFP）融合的蛋白中快速高效回收具有抗菌活性的嗜热乳杆菌素的方法。细胞裂解后，不溶部分中的浓缩融合蛋白被溶解并脱盐，随后通过蛋白酶factor Xa处理将嗜热乳杆菌素从GFP上切割下来。由于嗜热乳杆菌素对各种膜和层析柱基质具有很强的吸附性，并且推测也会吸附在GFP上，因此通过柱纯化及包括超滤在内的过滤方法难以高效收集嗜热乳杆菌素。将混合物置于沸水中加热被发现是一种有效选择性地去除GFP的方法，随后离心。由于嗜热乳杆菌素具有极高的耐热性，具有高抗李斯特菌活性的可溶性嗜热乳杆菌素保留在回收的上清液中。本研究证明，通过切割融合伴侣的热变性和离心，可以快速高效地回收重组嗜热乳杆菌素。

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大肠杆菌培养

大肠杆菌细胞在含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中于37°C培养过夜。重组蛋白表达培养在37°C的100 mL培养基中进行。当OD₆₀₀达到0.6时，加入0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），并在18°C下继续孵育过夜。

遗传操作

一个由I位点、His标签、SalI位点、factor Xa蛋白酶位点、pedA基因和BamHI位点组成的片段，使用LA Taq DNA聚合酶通过重叠延伸PCR进行合成

融合蛋白的产生和嗜热乳杆菌素的切割

无论可溶部分还是不溶部分，根据是否存在IPTG诱导，均观察到荧光强度的明显差异（图2A和B）。荧光可视化结果表明，用于纯化的足量GFP-嗜热乳杆菌素融合蛋白不仅存在于可溶部分，也存在于不溶部分中。取自含有和不含IPTG的细胞裂解物中可溶部分和不溶部分的蛋白质

嗜热乳杆菌素的非特异性结合特性

本研究提示嗜热乳杆菌素PA-1对注射器滤器、Ni–NTA柱及其融合伴侣GFP具有高结合特性。这种结合特性被认为会阻碍在使用注射器滤器、超滤膜或Ni-NTA柱时嗜热乳杆菌素与其融合伴侣GFP的分离。嗜热乳杆菌素肽链分为两个区域：亲水性、阳离子性且高度保守的N端区域，以及多样且疏水性或两亲性的C端区域

CRediT作者贡献声明

Reina Osanai：形式分析，数据整理。Isamu Maeda：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿撰写，验证，监督，经费获取，形式分析，数据整理，概念构思。

声明：在稿件准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术

在准备本工作的过程中，作者使用了Microsoft Copilot来协助英语编辑和审阅者回复的撰写。作者对所有生成的文本进行了审阅和必要编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。

致谢

本研究未获得来自公共、商业或非营利部门的任何特定基金资助。作者声明不存在利益冲突。

Reina Osanai|Isamu Maeda