《Advanced Materials》：Bottom-Up Engineering of a Human Neuromuscular System for Modeling Activity-Induced Remodeling, Metabolic Stress, and Endothelial-Modulated Excitability
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人体神经肌肉系统的体外模型能够重现神经肌肉连接的关键特征，并越来越多地被用于研究疾病机制。然而，活动依赖性适应以及内皮细胞（ECs）的贡献在体外模型中仍未得到充分体现。本研究建立了一种自下而上、基于微芯片的方法，该方法支持三维（3D）人体肌肉的运动神经支配，并
人体神经肌肉系统的体外模型能够重现神经肌肉连接的关键特征，并越来越多地被用于研究疾病机制。然而，活动依赖性适应以及内皮细胞（ECs）的贡献在体外模型中仍未得到充分体现。本研究建立了一种自下而上、基于微芯片的方法，该方法支持三维（3D）人体肌肉的运动神经支配，并允许局部或浸浴施加明确的化学刺激。相同的架构还支持内皮向内生长，产生同时具有神经和内皮整合的肌束。重复的局部L-谷氨酸刺激诱导了与活动依赖性肌肉适应相关的结构、代谢和转录变化，而高糖暴露则产生了不同的、 largely 相反的反应。ECs的加入进一步改变了运动神经元（MNs）和受神经支配的肌纤维中的钙动力学。这种模块化方法能够在工程化人体神经肌肉系统中对神经、代谢和内皮信号的反应进行可控研究。
**论文解读：工程化人类神经肌肉系统的自下而上构建及其在活动依赖性重塑、代谢应激与内皮调控研究中的应用**
**1. 研究背景与问题**
骨骼肌是人体中最具可塑性的组织之一，其发育、功能维持和稳态高度依赖神经支配。运动神经元（MNs）通过神经肌肉接头（NMJ）释放乙酰胆碱，驱动肌肉收缩，并持续调节肌肉的结构、代谢和基因表达。从胚胎晚期到成年，神经活动模式、代谢环境以及血管化程度共同塑造肌肉表型。然而，目前对人类肌肉生理和病理的研究主要依赖动物模型和人体实验，这些方法难以分离复杂的系统性相互作用，且存在伦理限制和种属差异。因此，亟需可控的、具有人类相关性的体外模型来研究肌肉对特定刺激的反应。
尽管已有的体外三维（3D）工程肌肉模型结合了电刺激或光遗传刺激来模拟运动，但大多数模型缺乏运动神经支配，无法重现神经-肌肉相互作用的完整生理环境。近年来出现了一些包含人类骨骼肌细胞和运动神经元的共培养模型，能够重建功能性神经肌肉连接，并应用于重症肌无力、肌萎缩侧索硬化症等疾病研究。然而，这些模型普遍缺乏内皮成分，且难以独立控制神经支配与外源刺激。此外，内皮细胞（ECs）对肌肉和神经功能的调节作用在现有神经肌肉模型中几乎未被探索。因此，需要一种模块化的、自下而上的工程策略，将运动神经支配、内皮整合和可控的外部刺激（如神经递质和代谢因子）同时纳入一个统一的实验平台。
**2. 研究内容与主要结论**
研究人员开发了一种基于微芯片的多层3D培养系统，通过水平固定梁锚定、水凝胶填充的微通道和分室设计，实现了人体肌束、运动神经元球体和内皮球体的空间可控共培养。该系统支持长距离的运动轴突生长和功能性神经肌肉接头的形成，并允许对神经室进行局部化学刺激。利用该系统，研究人员系统研究了长期3D培养、运动神经支配、重复局部L-谷氨酸刺激和高糖应激对肌肉和神经元的影响，并进一步探究了内皮整合对神经肌肉功能（尤其是钙动力学）的调节作用。
研究得出以下主要结论：第一，与2D培养相比，3D微芯片培养显著促进了肌管的成熟，表现为肌营养不良蛋白的正确膜定位、晚期肌源性标志物表达升高以及更大的乙酰胆碱响应钙瞬变。第二，运动神经支配本身即可改变肌肉基因表达，上调PGC-1α（PPARGC1A）、MYH1、MYH2和MYH7等与氧化代谢和慢肌纤维相关的基因。第三，重复的局部L-谷氨酸刺激（模拟神经元活动）诱导了活动依赖性肌肉适应，表现为纤维直径增加、横纹比例升高、GLUT4表达和胰岛素刺激的葡萄糖摄取增强，以及线粒体膜电位升高。第四，高糖暴露则诱导了一种 largely 相反的应激反应，包括PGC-1α、MYH7、NRF1下调，氧化应激（CellROX荧光增强）和线粒体去极化（TMRM荧光减弱），表明该系统能区分生理性适应与代谢应激。第五，内皮整合（通过HUVEC球体）显著改变了运动神经元和肌纤维的钙动力学，提高了神经元钙振荡的幅度和频率，并增强了肌肉对谷氨酸刺激的钙响应。
该研究发表在《Advanced Materials》上，其重要意义在于提供了首个同时包含神经、肌肉和内皮成分且可独立施加局部刺激的人类神经肌肉芯片模型，为解析神经活动、代谢应激和内皮信号如何共同塑造人类肌肉表型提供了可控的研究平台。
**3. 关键技术方法**
研究人员采用了以下主要技术方法：（1）多层软光刻微芯片制造，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制模具和激光切割膜组装，形成带有固定梁锚定结构和微通道的分室培养腔。（2）人原代骨骼肌成肌细胞（HSMMs，购自Lonza，来自健康供体上臂或腿部肌肉）与I型胶原-Matrigel水凝胶混合，在芯片内自组装形成各向异性3D肌束。（3）人小分子神经前体细胞（smNPCs）在微孔阵列中生成均匀的运动神经元（MN）球体，通过嘌呤吗啡胺（Pur）、维甲酸（RA）和DAPT的时序优化定向分化为MN样表型。（4）HUVECs（人脐静脉内皮细胞）培养并形成内皮球体，与肌束和MN球体进行三培养。（5）局部L-谷氨酸刺激范式，精确控制神经室刺激，并结合钙成像（Fluo-4）、qRT-PCR、免疫荧光、TMRM线粒体膜电位检测、CellROX氧化应激检测、2-脱氧葡萄糖摄取分析及MUSCLEMOTION肌肉收缩分析等评估组织功能。
**4. 研究结果**
**4.1 微芯片人类神经肌肉模型的设计**
研究人员设计了多层微芯片，包含肌束室、MN球体室和EC室，通过水凝胶填充的微通道连接（图1a,b）。水平锚定梁提供机械约束，促进肌束各向异性排列；开放的培养室允许直接操作和局部或浸浴施加化学刺激。这种设计将肌束、球体和通道置于大致相同的成像平面，利于长距离整合和高分辨率观察（图1c,d）。
**4.2 锚定3D人类肌束的形成**
将HSMMs包埋于I型胶原-Matrigel水凝胶中注入微芯片培养腔。与悬臂梁相比，固定端梁在培养过程中表现出最小的偏转，提供更稳定的边界条件（图2a）。3D培养的肌细胞形成更致密、排列更好的多核肌管，肌营养不良蛋白在3D培养中呈现清晰的膜定位，而2D培养中未见此模式（图2c,d）。3D培养中肌源性标志物（MYOD、MYOG、MYF6）和成熟标志物（MYH1、MYH2）的表达随时间增加，而2D培养中这些标志物下降（图2e）。3D肌束对100 μM乙酰胆碱的钙响应显著大于2D培养（图2f）。
**4.3 均匀MN球体的生成**
利用微孔阵列将从smNPCs分化的细胞生成大小均匀的球体。优化RA、Pur和DAPT的处理时间和浓度后，球体在D6后经DAPT处理4-6天，显著上调MN标志物ISL1、HB9和ChAT（图3c,d）。至第10-12天，球体形成极性化的梨形形态，ISL1阳性区域占DAPI阳性区域的76.9% ± 10.3%（图3f,g）。每个微孔阵列可一致地生成超过300个均匀的MN球体。
**4.4 定向神经整合与远程肌肉组织**
比较不同水凝胶后，选择1.0 mg/mL胶原-20% Matrigel混合物填充微通道，该混合物抵抗细胞介导的压缩并支持轴突生长（图4b）。共培养后，MN轴突沿通道延伸并到达肌束，形成SV2阳性轴突末梢与α-银环蛇毒素（BTX）阳性乙酰胆碱受体簇的共定位，提示形成假定的NMJs（图4c）。肌肉对L-谷氨酸（200 μM）的钙响应被筒箭毒碱完全消除，证实了功能性胆碱能传递（图4d）。运动神经支配还上调了肌肉中PPARGC1A、MYH1、MYH2、MYH7的表达（图4e），并改变了MN球体的基因表达谱（图4f）。
**4.5 局部谷氨酸刺激范式的建立**
从第24天开始，每天在MN球体室施加1 μL的100或500 μM L-谷氨酸，孵育3分钟后稀释，持续7天。荧光示踪剂实验显示该程序可将刺激大致限制在MN室附近（图5b）。刺激剂量和频率影响肌肉基因表达：每日刺激增加PPARGC1A和MYH7并降低MSTN，而每12小时刺激在100 μM下更显著增加MYH1和MYH2（图S19）。
**4.6 运动神经支配及活动诱导的神经肌肉重塑**
共培养3个MN球体并反复刺激后，肌纤维呈现清晰的TITIN阳性横纹，GLUT4表达和胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加（图5h,i）。反复谷氨酸刺激上调PPARGC1A、MYH2、MYH7、GLUT4、UCP3、NRF1和NR4A3（图6a），同时增加纤维直径、TMRM荧光强度（反映线粒体膜电位升高）以及谷氨酸诱发的局部抽搐频率（图6b,d-f）。MN球体在反复刺激后也表现出HB9、ChAT、RBFOX3、SV2A和谷氨酸受体表达的升高，以及基础钙荧光和后续刺激响应的增强（图S24,S25）。
**4.7 高糖应激的神经肌肉反应**
从第24天至第31天暴露于40或80 mM高糖培养基（基础培养基含20 mM葡萄糖）。高糖显著降低肌肉中PPARGC1A、MYH7、NRF1表达，升高MYH1和PDK4（图7c）。高糖增加细胞核CellROX荧光（氧化应激）并降低TMRM荧光（线粒体去极化）（图7e,f）。仅在80 mM条件下观察到GLUT4蛋白减少（图7g）。甘露醇渗透压对照未出现类似变化，表明这些效应主要由高糖本身而非渗透压引起。高糖还降低MN球体中HB9和RBFOX3表达（图S27）。需注意，该模型代表严重高糖应激而非临床高血糖。
**4.8 内皮整合调节MN和肌肉细胞的钙反应**
将HUVEC球体与MN球体分别置于肌束两侧进行三培养。HUVECs在纤维蛋白-胶原混合水凝胶中存活并形成网络样结构包绕肌束（图8b,c）。三培养条件下，MN钙振荡的峰值幅度显著增加，峰间间隔缩短（图8e）。在肌肉细胞中，反复谷氨酸刺激降低了自发性钙活动，但在最终给予100 μM L-谷氨酸后，三培养和反复刺激组均表现出更高的平均和最大ΔF/F0以及更短的达峰时间（图8f）。这表明内皮整合和既往兴奋经历共同调节神经和肌肉的兴奋性。
**5. 讨论与结论**
本研究的讨论部分指出，该微芯片模型成功整合了运动神经支配、内皮成分和可控外部刺激，能够区分活动依赖性适应（谷氨酸刺激）和代谢应激（高糖）诱导的 largely 相反的反应。然而，观察到的肌肉适应程度弱于直接电或光遗传刺激的报道，这可能反映了肌束神经支配不完全、缺乏髓鞘和终末施万细胞等问题。此外，局部谷氨酸刺激的时间分辨率不足以模拟高频或精确模式的突触输入。未来需引入光遗传学MN控制以实现时间精确刺激。结论部分强调，该自下而上构建的具有运动神经支配的肌肉芯片模型为研究神经活动、代谢应激和内皮整合如何塑造人类肌肉表型和神经肌肉功能提供了一个可控的实验平台。总体而言，这项研究在器官芯片领域实现了神经-肌肉-内皮三要素的整合，为神经肌肉疾病的机制研究和药物筛选开辟了新途径。
