许多神经退行性疾病都与不稳定的遗传元素有关，例如基因编码区或调控区内的重复序列1, 2, 3。尽管这些重复DNA序列的有害效应是由复杂的体内过程（包括转录、DNA修复4和翻译5）引起的，但遗传信息的异常传递——如DNA复制过程中的重复序列缺失或扩增6——可能是疾病发展的关键初始步骤。这些重复序列的遗传缺陷复制可能是由于单链DNA(ssDNA)容易形成非典型或替代DNA结构7所致。在DNA复制过程中，由解旋酶从双链DNA(dsDNA)解旋产生的ssDNA在作为模板之前往往会先形成稳定的二级结构。这些非典型的DNA结构（如发夹结构、十字形结构和三链结构）可能成为DNA聚合酶的障碍，从而导致复制错误和蛋白质解离8, 9, 10, 11。
研究重点在于了解重复序列导致的基因组不稳定性如何引发毒性后果。研究发现的一个共识是，这些重复序列相对于复制起点的位置和方向对其毒性效应起着关键作用12。另一个关键问题是这些重复序列在DNA复制过程中是如何被延伸的。虽然大多数研究关注的是细胞层面的影响，但鲜有研究探讨三核苷酸重复序列对DNA复制本身的影响。例如，使用T4噬菌体系统的研究表明，负链上的强二级结构可能导致DNA聚合酶与解旋酶分离，从而造成复制不完全13, 14, 15。具有更全面组成的T7复制体可能为研究涉及重复序列模板的复制事件提供更深入的见解。
噬菌体T7的DNA复制体是一个最小化且功能完备的系统，能够复制双链DNA(dsDNA)模板。它由T7基因4 DNA引物酶-解旋酶、T7基因5 DNA聚合酶、E. coli硫氧还蛋白和T7基因2.5 ssDNA结合蛋白组成，这些成分共同协调正链和负链的合成16, 17。这些成分与DNA之间的相互作用已被广泛研究，使得T7复制体成为研究重复序列如何影响DNA复制的理想模型17。
在这项研究中，我们利用T7噬菌体复制体探讨了三核苷酸重复序列（CTG和CAG）对DNA复制的影响。首先评估了重复序列与单个复制蛋白的相互作用，随后对整个复制复合体进行了全面分析。此外，还将这些重复序列整合到T7基因组中，以研究它们在体内的维持机制。
为了比较重复序列对DNA合成的影响，我们构建了含有25个三核苷酸重复序列（CAG或CTG）或相同长度随机序列的线性模板。这些模板包含一个通用序列，一个15个核苷酸的引物可以与3′区域退火（图1A）。我们通过测量T7 DNA聚合酶对32P标记引物的延伸程度来评估核苷酸聚合的效率。在CAG重复序列模板上合成的全长90个碱基对（bp）产物的数量约为随机序列模板的80%，而CTG重复序列模板的产物量显著较低（约20%）（图1B）。
T7 DNA聚合酶对DNA合成的抑制伴随着新添加核苷酸的切除或酶的校对外切核酸酶活性导致的引物降解18。在高浓度聚合酶的作用下，特别是在CTG模板中，凝胶底部观察到了降解产物（图1A）。全长产物量的减少以及更多降解产物的存在表明，含有重复序列的模板上的DNA合成效率低于随机序列模板。在较高聚合酶浓度和CTG模板上，降解现象更为明显，这与重复的核苷酸添加循环及3′→5′外切去除（空转）过程一致，因为聚合酶在结构化模板处停滞。
单链DNA结合蛋白可以通过与DNA模板结合并去除干扰聚合酶进动的二级结构来调节DNA聚合酶的活性19, 20。我们评估了T7基因2.5 ssDNA结合蛋白（gp2.5）和E. coli ssDNA结合蛋白（SSB）对DNA聚合的影响。添加T7 gp2.5可使随机序列模板上完全延伸产物的产量增加2.5倍（图1B），但在重复序列模板上未观察到此类增强效果。相比之下，E. coli SSB使所有模板上的聚合活性提高了2到5倍，其中CTG模板上的提升最为明显（图1B）。
三核苷酸重复序列对DNA合成的抑制可能是由于替代碱基配对或阻断DNA聚合酶进动的二级结构所致。E. coli SSB克服这种抑制的能力支持了这一解释。然而，T7 gp2.5的不同效应表明ssDNA结合蛋白与三核苷酸重复序列之间存在不同的相互作用。为了进一步研究，我们通过电泳迁移率测定比较了T7 gp2.5和E. coli SSB与含有随机或重复序列的90个核苷酸长度的ssDNA的结合能力（图2）。每个90个核苷酸长度的ssDNA都分别与不同浓度的蛋白质孵育，然后将结合蛋白质的DNA与未结合的DNA在天然凝胶上分离。实验中还包括了一种含有交替A/T序列的80个核苷酸长度的DNA，这种序列以易于形成二级结构而闻名。
T7 gp2.5以浓度依赖的方式与随机序列DNA结合，但在最高浓度的gp2.5下其对含有CAG重复序列的DNA结合较弱（图2A）。在不加入蛋白质的情况下，含有CTG重复序列或A/T序列的DNA产生了延迟迁移的产物，表明形成了二级结构。然而，这两种序列均未与T7 gp2.5结合。E. coli SSB在高蛋白浓度下可以与同时含有CAG和CTG重复序列的DNA结合，尽管其结合强度低于随机序列DNA（图2B）。E. coli SSB更容易与CAG重复序列DNA结合。由于含有重复序列的模板会形成多种电泳产物，而不是作为一个单一的离散复合体移动，该实验报告的是相对结合行为，而非真正的平衡解离常数。
这些结果表明，重复序列较难被T7 gp2.5和E. coli SSB结合，这可能是由于形成了二级结构。与CAG重复序列相比，CTG重复序列对蛋白质结合的抑制更为明显。与T7 gp2.5相比，E. coli SSB似乎具有更强的能力来消除重复序列的二级结构，这与其在含有重复序列的模板中对DNA聚合的更强促进效果一致（图1）。DNA合成和结合实验都表明，重复序列的二级结构具有抑制作用，且在CTG重复序列中这种抑制作用更为显著。
