烷基三甲基铵化合物对人和大鼠胎盘3β-羟基类固醇脱氢酶的链长依赖性抑制作用：机制及潜在的生殖毒性

《Journal of Molecular Structure》：Chain-Length-Dependent Inhibition of Human and Rat Placental 3β-Hydroxysteroid Dehydrogenases by Alkyltrimethylammonium Compounds: Mechanisms and Predicted Reproductive Toxicity

　　

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  ATMAs（烷基三甲基铵化合物）能够抑制3β-HSD酶，这是胎盘中产生孕酮的主要酶。
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  对h3β-HSD1的抑制具有V形选择性亲和力（SAR）谱，其中C18结构的ATMA抑制作用最强。
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  细胞实验验证了ATMs暴露会降低孕酮的分泌量。
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  物种特异性的结合口袋几何结构解释了它们不同的抑制效力。
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  网络毒理学研究表明3β-HSD的抑制与胎儿生长受限有关。

引言

全球COVID-19大流行导致了消毒剂使用的空前增长，尤其是季铵化合物（QACs）[2]，其中烷基三甲基铵化合物（ATMAs）尤为突出（图1a）[[3], [4], [5], [6]]。ATMAs广泛用于家用清洁剂、医院消毒剂和个人护理产品中，并被公共卫生机构推荐用于对抗SARS-CoV-2的表面消毒，这导致了它们在环境中的大量释放和人类的暴露[7,8]。因此，在人类血液、尿液、母乳和胎盘组织中都检测到了ATMAs，引发了对其潜在健康影响的严重担忧，尤其是对内分泌和生殖系统的影响[2,9,10]。

先前的研究表明，怀孕期间的某些因素可能会影响分娩和胎儿生长[11]，流行病学和毒理学研究将QACs暴露与一系列副作用联系起来，包括精子质量下降、月经不规律和不良妊娠结局[2,9,10]。例如，ATMA衍生物苯扎氯铵通过抑制芳香化酶的功能在人类和大鼠中表现出抗雌激素作用[12]，同时还具有发育毒性和胎盘功能障碍[12,13]。这种内分泌干扰尤其威胁到调节生殖和产前发育的关键生物系统。这些观察结果表明，ATMAs可能干扰类固醇激素的生物合成，而这一过程对生殖功能至关重要。这一途径中的关键酶是3β-羟基甾体脱氢酶（3β-HSD），它使用NAD?作为辅因子，催化Δ?-3β-羟基甾体（如孕烯醇酮，PN）转化为Δ?-3-酮甾体（如孕酮，PO）[14,15]。在人类中，胎盘中的h3β-HSD1（由HSD3B1基因编码）对维持妊娠期间的孕酮水平至关重要，而其大鼠同源物是r3β-HSD4。催化机制涉及一组保守的残基，通常是Tyr154、Lys158和一个丝氨酸或组氨酸，这些残基有助于将氢负离子从类固醇转移到NAD?上并随后发生异构化。孕酮（PO）是胎盘3β-HSD活性的主要生物合成产物，对于建立和维持妊娠是生理上不可或缺的，其作用机制包括：促进子宫内膜蜕膜化以利于胚胎着床、调节母体免疫反应以支持胎儿耐受性、抑制子宫肌收缩以防止早产以及支持子宫胎盘血管的重塑以优化血流[16,17]。因此，暴露于任何能够抑制胎盘3β-HSD的化合物都可能导致孕酮局部缺乏；这种缺乏可能会扰乱诸如适当的蜕膜化和适当的免疫调节等关键过程，最终可能导致妊娠丢失——从而建立了一种合理的机制路径，将此类化合物（如ATMA）的暴露与胎儿生长受限（FGR）和反复自然流产（RSA）的发生联系起来。

尽管ATMAs被广泛使用并且已知具有生殖毒性，但这些化合物对3β-HSD亚型的具体影响仍不完全清楚。以往的研究主要集中在其他内分泌干扰物（ED，如邻苯二甲酸酯、双酚类、杀菌剂）[18]上，但尚未研究ATMAs的烷基链长度如何影响其抑制效力、物种选择性或作用机制（MOA）。这是一个重要的研究空白，因为常见的ATMs链长从C12到C22不等，它们的脂溶性和立体性质差异很大。此外，它们与酶的NAD?结合位点的相互作用机制、对细胞孕酮生成的后果，以及抑制作用与不良妊娠结局之间的下游途径尚未阐明。

尽管有令人担忧的流行病学证据表明抗菌化学品[17]的暴露与生殖或其他健康问题[19,20]有关，但仍存在许多研究空白。为了填补这些空白，本研究旨在通过一系列烷基链长度从C1到C22的ATMs来研究h3β-HSD1和大鼠r3β-HSD4的抑制作用。我们的具体目标是：（1）建立结构-活性关系[17]并开发三维定量结构-活性关系（3D-QSAR）药效团模型，以确定控制效力的关键物理化学特征；（2）通过酶动力学分析确定抑制强度（半数抑制浓度IC??）和作用机制（MOA）；（3）进行分子对接和分子动力学模拟（MDS），以表征结合模式和物种特异性的结合口袋尺寸；（4）使用JAr人胎盘绒毛膜癌细胞在细胞水平上验证功能抑制作用，通过测量孕酮的形成；（5）运用网络毒理学分析[21]，将h3β-HSD1的抑制作用与RSA和FGR背后的生物学途径联系起来。通过整合实验酶学、计算建模、细胞实验和毒理学，这项工作为理解ATMs的生殖毒性提供了机制框架，并为这些普遍存在的环境污染物的风险评估提供了依据。

章节片段

化学物质和生物样本

ATMAs的供应商如下（化学物质的纯度超过98%）：C1（CAS号75-57-0，目录编号R001037，Rhawn，上海，中国），C8（CAS号10108-86-8，目录编号BD145360，Bidepharm，上海，中国），四乙基铵氯化物（TEA，CAS号56-34-8，目录编号Q108482，Dibai，上海，中国），四丁基铵氯化物（TBA，CAS号1112-67-0，目录编号K909232，Dibai），C10（CAS号10108-87-9，目录编号Q101241，Dibai），C12（CAS号112-00-5，目录编号BD16186），

ATMAs根据烷基链长度抑制h3β-HSD1活性

我们利用人胎盘微粒体表征了h3β-HSD1的酶动力学，以评估ATMs的抑制潜力并确定最有效的衍生物（图2a）。酶活性符合MM动力学，底物PN的Km值为0.378 ± 0.04 μM（图2b）。这个Km值与其他在相同实验条件（PBS缓冲液，pH 7.2）下报告的值一致，验证了实验系统的可靠性[23,34,35]。酶表现出高催化活性

讨论

本研究首次将ATMs作为人和大鼠胎盘3β-HSD亚型的抑制剂进行了表征，发现了由烷基链长度决定的显著选择性亲和力谱（SAR）。主要发现是ATMs通过混合/非竞争机制抑制h3β-HSD1和r3β-HSD4，且具有不同的物种特异性效力。对于h3β-HSD1，抑制作用呈现V形曲线，其中C18结构的ATMA抑制作用最强（IC?? = 4.31 μM），而较短的链（C18）显示出

结论

我们的研究结果表明，ATMs是值得关注的环境生殖毒素。这些化合物在低微摩尔浓度下就能通过抑制3β-HSD来抑制人类和大鼠的胎盘孕酮生成。这种抑制作用通过混合/非竞争机制实现，并高度依赖于烷基链长度。此外，结构和建模分析表明，脂溶性和立体性质决定了它们的抑制效力，以及它们与NAD?结合位点的确切相互作用

CRediT作者贡献声明

Xishi Chen：撰写——原始草稿，项目管理，方法学，正式分析。Boyan Cen：方法学，数据管理。Yanghao Shen：正式分析，数据管理。Huiling Deng：验证，调查。Ruijuan Gao：验证，调查。Sen Yang：资源，概念化。Yongqiang Wang：资源，概念化。Jingru Wang：资源，概念化。Fengzhan Yang：验证。Zijing He：验证。Ren-shan Ge：撰写——审阅与编辑，资金获取，

利益冲突声明

我们声明与任何可能不当影响我们工作的个人或组织没有财务和个人关系，也没有任何形式的专业或其他个人利益会影响到本文所述的内容或手稿的审阅。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金会（资助编号82371610，资助给R.S.G.）以及浙江省自然科学基金会（资助编号LY22H040010，资助给R.S.G.）的支持。我们感谢温州医科大学科研中心的咨询和仪器支持。

Xishi Chen|Boyan Cen|Yanghao Shen|Huiling Deng|Ruijuan Gao|Sen Yang|Yongqiang Wang|Jingru Wang|Fengzhan Yang|Zijing He|Ren-shan Ge|Ying Su