综述：自身免疫疾病中T细胞受体库（TCR Repertoire）改变格局的绘制

《Immunological Reviews》：Mapping the Altered Landscape of TCR Repertoire in Autoimmune Diseases

　　

自身免疫疾病源于遗传易感性、环境暴露与适应性免疫应答之间复杂相互作用导致的免疫耐受崩溃。高通量T细胞受体（TCR）库测序技术极大地提升了我们对这些应答的表征能力，为克隆动态、抗原驱动选择和免疫历史提供了前所未有的见解。在本综述中，我们总结了各类自身免疫疾病中报道的TCR库的主要改变，包括多样性、克隆扩增、库结构及组织分布的变化。我们讨论了目前限制库解读的主要生物学和技术挑战，特别强调了“整体库代表生物学上不同的T细胞群体的复合混合物”这一概念。最后，我们重点介绍了正在重塑该领域的新兴方法，包括单细胞分析、计算建模和抗原特异性推断。我们提出，应将TCR库视为自身免疫疾病的动态分子足迹，它为改善机制理解、生物标志物发现以及精准免疫疗法的发展提供了一个系统层面的框架。

1 T细胞在自身免疫疾病中的简要概述

1.1 自身免疫疾病：适应性免疫失调的连续谱

自身免疫疾病（ADs）是慢性和致残性疾病，是全球慢性病的第二大病因，由于疗效不佳的治疗方案和高昂的费用以及危及生命的副作用给患者生活质量带来负面影响，造成了严重的社会负担。现有治疗方法均非疾病特异性或治愈性的，因此对新型疗法和更深入理解病理生理学的需求尚未得到满足。目前已表征的ADs超过80种，其发病率和患病率在过去几十年中全球范围内持续上升，且在女性/男性比例上存在失衡。ADs通常分为系统性ADs（如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、干燥综合征（SjD））或器官特异性ADs（如1型糖尿病（T1D）、多发性硬化症（MS）），它们共同构成一组异质性疾病谱而非纯粹的独立疾病。普遍认为，ADs是由患者的T淋巴细胞和B淋巴细胞的适应性免疫应答攻击自身机体所致。许多研究已证明先天免疫在多种ADs中的重要作用，尤其是在疾病发作期，然而先天细胞极大地促进了自身反应性T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活。此外，已鉴定出多种与T细胞和B细胞生物学相关的遗传变异关联，包括HLA等位基因、T细胞活化或自身反应性B细胞分化相关基因，其中一些在不同ADs间是共享的。环境因素，如化学物质、烟草暴露、药物摄入、内分泌干扰物、感染和共生微生物，也影响着疾病的发病率和患病率。最后，患有一种AD的个体可能随时间发展出其他ADs，某些疾病组合很常见，例如SLE、RA和干燥综合征（SjS）。这三种ADs不仅经常重叠，而且共享临床血清学和免疫学特征，提示可能存在共同的病因学因素和病理生理学，支持了疾病连续谱的概念。

1.2 绘制自身免疫的适应性免疫图谱

T细胞和B细胞在ADs中扮演着复杂角色。近期成功的靶向治疗，无论是针对T细胞还是B细胞或B-T细胞串扰，进一步支持了这些细胞在AD中的主要作用。尽管如此，这种泛B细胞和泛T细胞耗竭疗法会靶向所有适应性免疫细胞，包括机体抵御病原体所需的细胞，限制了这类疗法的推广。B细胞标志物不足以理解和界定ADs；T细胞及其与B细胞的串扰在AD背景下仍有待探索。在许多自身免疫疾病中，B细胞通过产生致病性自身抗体发挥核心作用。这一点在SLE中尤为明显，抗核自身抗体（ANA）驱动免疫复合物形成和组织损伤，但在重症肌无力、寻常型天疱疮、自身免疫性甲状腺疾病和ANCA相关性血管炎中也同样如此，其中自身抗体直接导致疾病病理。在RA中，抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）是关键因素和生物标志物。它们的产生据推测依赖于B细胞和T细胞，提示可能存在抗瓜氨酸化蛋白特异性T细胞。在T1D中，靶向胰岛素、GAD65、IA-2或ZnT8的自身抗体是可检测到的自身免疫最早迹象之一，是疾病进展的有力预测因子，尽管β细胞破坏被认为主要由自身反应性T细胞介导。越来越多的证据表明，B细胞的贡献超越了体液免疫。通过抗原呈递、细胞因子产生以及与T细胞的相互交互，B细胞参与了一系列广泛疾病中自身免疫反应的起始和维持，包括RA、MS、T1D和原发性干燥综合征（pSjD）。因此，B细胞靶向疗法已成为几种自身免疫疾病治疗的基石，证明B细胞不仅通过自身抗体产生，还通过抗原呈递、细胞因子分泌和维持致病性T细胞反应来促进发病。组织中驻留B细胞的不完全耗竭以及长寿命浆细胞的持续存在常常限制了临床反应的深度和持久性。基于这些观察，新一代免疫靶向方法，包括CD19导向的CAR-T细胞，已在严重的难治性系统性红斑狼疮中诱导了持久的无药缓解，而新兴的T细胞衔接器策略可能提供同样有效且更具可扩展性的方法来消除致病性B细胞群并实现持久的免疫重置。因此，自身免疫疾病并非源于孤立的B细胞异常，而是由T-B细胞相互交互所维持的失调适应性免疫网络所致。抗原特异性T细胞是否通过为自身反应性B细胞提供帮助并指导组织特异性免疫应答来协调许多此类相互作用，已成为破译自身免疫疾病机制的核心问题。同样，T细胞在自身免疫疾病的起始、传播和维持中也处于中心地位。CD4辅助性T细胞亚群通过细胞因子产生和免疫细胞募集来协调炎症反应，其中Th1和Th17细胞在MS、RA、银屑病、炎症性肠病（IBD）和T1D等疾病中发挥着突出作用。自身反应性T细胞可能通过多种非互斥机制促成疾病。与此同时，滤泡辅助性T细胞（Tfh）已成为体液自身免疫的关键介质。通过产生IL-21和与B细胞直接相互作用，Tfh细胞促进生发中心反应、亲和力成熟和自身抗体产生。在SLE、RA、ANCA相关性血管炎、pSjD和其他抗体介导的自身免疫疾病中已报道有Tfh群体扩增，其与疾病活动和自身抗体水平相关。相反，调节性T细胞（Tregs）的缺陷，无论是数量上的、功能上的还是组织特异性的，都导致了外周耐受的破坏，并在众多自身免疫疾病中被报道。Treg介导的调节的重要性进一步得到了旨在恢复Treg稳态的治疗方法的支持，包括在SLE和T1D等疾病中使用低剂量IL-2和过继性Treg疗法。除了辅助功能外，T细胞还可以作为组织损伤的直接介导者。CD8细胞毒性T细胞被认为是几种自身免疫疾病中的主要致病效应细胞，尤其是在器官特异性疾病中。在T1D中，自身反应性CD8 T细胞直接介导胰腺β细胞破坏，并且是胰岛内的主要免疫群体。有趣的是，它们在血液中的存在并不代表疾病，因为在健康志愿者中也能发现它们。同样，克隆性扩增的CD8 T细胞在MS的炎症病灶内富集，被认为有助于神经元和少突胶质细胞损伤。组织驻留和克隆性扩增的CD8 T细胞群体也被牵涉到广泛的自身免疫疾病中，包括类风湿关节炎、原发性干燥综合征、白癜风、强直性脊柱炎和狼疮肾炎。近期的单细胞和配对TCR研究揭示，这些群体经常表现出慢性抗原刺激、组织适应和局部克隆扩增的特征，支持持续性抗原驱动反应在自身免疫病理学中的核心作用。CD8 T细胞也可能通过释放促炎细胞因子在疾病中发挥作用，然而一项近期研究表明其在维持促炎环境中具有抗原非依赖性作用。在自身免疫疾病中，HLA-B27相关的强直性脊柱炎（AS）及相关的中轴型脊柱关节炎（axSpA）提供了将TCR库改变与疾病发病机制联系起来的最令人信服的例子之一。在患者中以及在炎症部位富集处，已鉴定出趋同和共享的CD8⁺ TCRs，后续研究将这些受体与HLA-B27限制性抗原识别和微生物-自身交叉反应性联系起来，并为治疗性靶向库定义的T细胞群体提供了初步概念验证。这些发现说明了如何通过对疾病相关TCR库的深入表征，超越仅仅记录T细胞参与，进而揭示抗原驱动机制，并潜在地识别可选择性地靶向的T细胞群体。总之，B细胞和T细胞并非孤立地行动。越来越多的证据表明，自身免疫疾病源于T细胞、B细胞、先天免疫群体、靶组织以及环境之间的复杂相互作用。特别是，T细胞-B细胞串扰已成为许多疾病中的一个主要致病轴。Tfh驱动的B细胞激活促进了自身反应性克隆和致病性自身抗体的产生，而B细胞反过来又通过抗原呈递和细胞因子产生来维持T细胞活化。总之，这些观察将抗原特异性T细胞反应置于自身免疫发病机制的中心，并为研究T细胞受体（TCR）库以识别疾病相关克隆、表征免疫失调以及揭示自身免疫的共享或疾病特异性机制提供了强有力的依据。

1.3 抗原特异性：自身免疫疾病的隐藏地形

尽管抗原特异性是适应性免疫的定义属性，但我们对驱动自身免疫疾病的抗原和抗原特异性淋巴细胞反应的理解仍然非常不完整。在少数疾病中，候选自身抗原已被鉴定并得到广泛表征。T1D是研究最充分的例子之一，针对胰岛素、GAD65、IA-2、ZnT8和其他β细胞抗原的自身反应性T细胞反应在临床发病前数年即可被检测到。尽管如此，大多数抗原特异性治疗方法取得的有限成功凸显了自身免疫反应的复杂性，并表明疾病发病机制不能完全由一小部分显性抗原解释。这也体现在最近评估的Diamyd疫苗中，该疫苗基于人重组GAD65，仅在一部分HLA-DR3-DQ2阳性的T1D患者中显示出临床获益。类似地，虽然针对SLE中的核抗原、RA中的ACPA或原发性干燥综合征中的Ro/La抗原的自身抗体构成了重要的诊断和预后标志物，但相应的T细胞特异性仍然只有部分被理解。增加复杂性的是，抗原特异性在整个疾病演变过程中不太可能保持静态。组织炎症和破坏会不断释放新的自身抗原，为招募和扩增识别先前未靶向表位的淋巴细胞创造了机会，这一过程被称为表位扩散。这种免疫反应的多样化已在几种自身免疫疾病中得到证实，并被认为有助于疾病进展、器官播散和治疗抵抗。同时，微生物和自身抗原之间的分子模拟可能启动或放大自身反应性反应，进一步模糊了环境和自身来源触发因素之间的界限。总之，这些观察结果表明，自身免疫疾病的特点并非固定的抗原靶点，而是动态且不断演变的抗原特异性免疫景观。对抗原特异性的不完全理解构成了机械洞察和治疗发展的主要障碍。由于TCR构成了抗原驱动免疫反应的分子记录，TCR库的表征为研究自身免疫疾病的抗原结构提供了独特的机会。除了识别疾病相关的克隆型之外，库分析还可以提供关于克隆扩增、免疫选择、趋同反应、疾病异质性和纵向免疫进化的见解，从而为了解维持自身免疫的机制提供一个前所未有的窗口。

2 TCR库的生物学基础

T细胞通过其TCR介导抗原特异性免疫，TCR是一个异二聚体跨膜蛋白复合物，在约95%的T细胞中由α链和β链组成。TCR库是在胸腺细胞发育过程中通过V(D)J重组产生的，这是一个随机的体细胞过程，其中可变基因区段、多样基因区段和连接基因区段被随机组装，β链经历V-D-J重组，而α链仅经历V-J重组，产生了估计从10¹⁵到10⁶¹种不同序列的理论多样性。互补决定区3，通常被认为是抗原特异性的主要决定因素，由于其跨越重组连接点并进一步受到连接处核苷酸插入和缺失的影响而特别多样化。而CDR1和CDR2由胚系V基因区段编码，主要接触MHC分子的保守螺旋残基，高度可变的CDR3环则主要与结合的肽段相互作用。TCRs识别抗原呈递细胞表面的这些肽-MHC复合物，包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，它们内化、蛋白水解加工并将抗原肽呈递给循环中的T细胞。这种识别是MHC类别限制性的：CD8⁺细胞毒性T细胞结合MHC I类分子上的肽段，MHC I类分子在有核细胞上普遍表达；而CD4⁺ T细胞结合MHC II类分子上的肽段，MHC II类分子主要局限于专职APCs。这种最初巨大的多样性随后通过连续的胸腺选择检查点进行塑造。阳性选择由皮质胸腺上皮细胞介导，这些细胞呈递独特的自身肽-MHC复合物，挽救了那些TCR以足够亲和力结合自身MHC的胸腺细胞。阴性选择随后消除了表现出高亲和力自身反应性的克隆，估计移除了所有阳性选择胸腺细胞的一半至三分之二。然而，胸腺选择天生是不完美的：25%-40%的自身反应性克隆可以逃逸删除，特别是低亲和力的克隆和携带第二个掩盖自身反应性的TCR的细胞。第三种胸腺结局是分化为Foxp3⁺调节性T细胞，它在一个广泛的自身反应性窗口中捕获自身反应性胸腺细胞：阴性选择所需的TCR反应性阈值大约比Treg分化所需的高100倍。这使得Treg区室富集了那些自身反应性强到足以促进调节性谱系定型，但又不足以诱导克隆删除的细胞。成熟的外周TCR库保留了显著的多样性，年轻成年人体内不同TCRβ克隆型的数量估计范围约为10⁶到10⁸。然而，这个库的功能性抗原识别能力远远超出了其数值大小。这是可能的，因为TCR识别是高度简并的：一个单一的TCR可以结合许多不同的肽-MHC配体，估计潜在的交叉反应性超过10⁶种不同的pMHC复合物。因此，广泛的免疫监视并非源自TCRs和抗原之间的一一对应关系，而是来自一个灵活的识别系统，在该系统中每个克隆型都会采样一大片抗原空间。外周耐受为逃逸胸腺删除的自身反应性克隆提供了一个必要的分层后备机制。Tregs是外周耐受的主要细胞介质，需要抗原特异性TCR信号传导以及IL-2依赖的生存和功能支持，使它们能够通过局部的旁观者机制抑制自身反应性效应反应，包括抑制性细胞因子、调节抗原呈递细胞和消耗白细胞介素2。关键的是，Treg库中的缺口可能会在外周耐受中造成脆弱性：当相关自身抗原在胸腺发育期间缺失时，同源Tregs可能无法产生，使得针对这些抗原的自身反应性反应得以出现。因此，成熟的TCR库不是一个随机的克隆型集合，而是一个结构化和动态的系统，其结构反映了重组偏好、胸腺选择、外周调节和抗原驱动扩张的累积印记。总的来说，TCR库可以被理解为发育史、免疫暴露和功能约束的一个演化记录，其破坏越来越被认为是自身免疫病理学的核心特征。

3 T细胞受体作为自身免疫反应的分子足迹

自身免疫疾病所特征的自我耐受的破坏不仅是一种功能现象，而且在TCR库本身上留下了独特的印记。高通量测序的进步使得以前所未有的分辨率表征这些库改变成为可能。理解这些特征对于阐明疾病机制以及识别疾病发作、活动和进展的生物标志物至关重要。本节概述了在自身免疫疾病中报道的主要TCR库改变，包括多样性降低和寡克隆扩增；抗原驱动选择的分子特征；改变的抗原识别景观；时空和区室库动态；公共克隆型和库共享；以及基于库的特征及其生物标志物潜力。

3.1 多样性降低和寡克隆扩增

在各种自身免疫疾病中，TCR库常表现出多样性降低和寡克隆扩增，反映了从广泛分布的克隆型使用向克隆偏斜的转变。在SLE中观察到明显的库收缩，纵向测序报告显示与健康对照组相比，TCR多样性降低了2.2倍。在RA中，多样性的降低和突出的克隆扩增与疾病活动和遗传风险背景相关，特别是在记忆CD4⁺ T细胞中；HLA-DRB1共享表位等位基因阳性的患者表现出显著的TCRβ库收缩，表现为克隆型频率增加10倍，同时与健康供体相比记忆CD4⁺ TCR多样性降低。在克罗恩病中，发炎的粘膜组织显示出多样性下降，包括D50多样性指数降低，同时扩增的克隆型富集，这与健康对照中看到的稀有克隆型的广泛分布形成对比。然而，在T1D中，情况更为微妙。一项研究报告称，与T2D患者和非糖尿病对照组相比，T1D中外周CD4⁺和CD8⁺多样性显著降低，同时伴有更高频率的扩增克隆型。然而，其他大规模分析发现，库水平的多样性和相似性指标在T1D和对照组之间并无显著差异。这种差异可能反映了T1D相关库改变的细微性和情境依赖性，包括在考虑其他临床参数时队列规模的影响。此外，它也强调了此类库改变可能无法通过传统的全局多样性指标检测出来，需要更敏感的方法，如基于机器学习的方法来解决。总的来说，这些发现支持了自身免疫库经常发生克隆收窄的观点，但多样性降低并非一个普遍或统一的特征。在一些多发性硬化症队列中报告的TCRβ多样性增加的报道进一步突出了库重塑的情境依赖性，它随疾病类型、取样组织、T细胞亚群和应用的分析指标而变化。

3.2 抗原驱动选择的分子特征

除了整体多样性的变化，自身免疫库通常还表现出克隆型组成的改变，包括偏向的V和J基因使用、优先的V-J配对以及CDR3长度分布和氨基酸组成的变化。这些特征表明，自身免疫库重塑可能不仅仅反映非特异性收缩，还可能涉及对具有特定结构和序列特性的受体的选择性扩增，这可能与在胸腺选择和MHC限制性约束下运作的抗原驱动选择一致。在多个自身免疫环境中均有报道偏向性V基因使用。在SLE和RA中，在患者和健康对照组之间观察到V基因使用、J基因使用和V-J配对的显著差异，仅V基因使用就在疾病和对照库之间显示出强大的区分性能，AUC达到0.99。在T1D中，抗原特异性T细胞显示出表位依赖的V-J限制：IGRP反应性CD8⁺ T细胞表现出近乎普遍的、跨患者共享的TRAJ53使用，而GAD65特异性CD4⁺ T细胞则显示出广泛多样的TRBV使用，没有跨患者的趋同性。类似的TRBV使用偏倚模式已在自身免疫性甲状腺疾病中被描述，格雷夫斯病和桥本甲状腺炎各自表现出部分重叠但疾病特异性的TRBV基因的优先使用，这表明即使在相关的自身免疫疾病中，V基因偏倚也可能反映不同的抗原靶点。在克罗恩病中，在肠道库中观察到基因使用的改变，与对照组相比，患者中几个TRAV、TRAJ和TRBV基因的使用显著减少。与上述模式一致，一项来自Transimmunom试验的内部数据集的探索性分析，这是一个包含多自身免疫和炎症性疾病患者的队列，同样揭示了与健康志愿者相比，在包括SLE、RA和T1D在内的几种疾病中，每种疾病都有优先的V基因使用，以及一些疾病间共享的基因。总之，这些发现表明，自身免疫库可能富集了特定的V/J基因组合，这潜在反映了某些人群中的遗传偏倚，包括HLA以及可能对疾病相关肽-MHC复合物的优先识别。

3.3 抗原识别景观

抗原驱动选择可以通过TCR固有的交叉反应性产生。由于潜在的肽-MHC宇宙远大于TCR库的大小，单个克隆型识别不止一种配体。微生物模拟是指病原体衍生的肽-MHC和自身肽-MHC激活同一TCR的情况，创造了一条从感染到自身反应性的可行途径。几个例子突显了这种病原体反应性与各种AD之间的联系。Hiemstra等人展示了一个来自患有僵人综合征的前驱糖尿病患者的GAD65反应性CD4⁺ T细胞克隆交叉识别了来自人巨细胞病毒主要DNA结合蛋白的一个肽段。病毒配体是通过HLA-DR3结合肽库筛选鉴定的，并被树突状细胞自然加工，确定了它对相关T细胞是可及的，而不仅仅是计算上可行的配体。Sethi等人解析了一个来自MS患者的MBP反应性TCR与自身肽和两个病原体衍生肽的复合物结构。一个聚焦的CDR3α相互作用主导了识别：残基F95在所有三个复合物中贡献了最多的肽段接触，而E98提供了一个关键的MHC接触。Harkiolaki等人进一步证明，一个与MBP共享结构识别热点的细菌肽可以激活相同的TCR并在人源化小鼠中诱导MS样疾病。Hy.1B11的分子动力学模拟随后支持了这一结构模型，在自身和微生物肽-MHC复合物中识别出相似的桥接相互作用模式，并强化了CDR3α E98-MHC相互作用的重要性。类似地，在HLA-B27相关的axSpA中，细菌YeiH肽和结构相关的由HLA-B*27:05呈递的自身肽可以被相同的疾病相关TCRs识别，涉及CDR3β和TRAV21的CDR1上的特定基序，为AD中基于共享微生物和自身pMHC配体结构特征的分子模拟提供了额外证据。在他们的研究中，Paley等人展示了YeiH特异性细胞显示出与肠道分化相关的表型和转录特征，进一步支持了粘膜暴露于微生物抗原与交叉反应性T细胞反应出现之间的可能联系。交叉反应性不需要广泛的整体TCR序列同一性。这种区别对预测很重要。交叉反应性配体集可能在肽段序列的其他地方保留一个保守的TCR面对识别热点，尽管存在大量多样性。因此，基于结构的建模可以补充基于序列和基序的特异性推断：Borrman等人使用TCR-pMHC建模和能量评分从包含超过10⁵个肽段的候选池中对已知交叉反应性配体进行排序。这些交叉反应性克隆是否会变得具有临床后果将取决于抗原暴露的时间和解剖背景。

3.4 自身免疫库的时空动态

自身免疫T细胞库不是一个单一的实体，而是一个空间分布、时间演化的群体。外周血只采样了少数疾病相关的克隆型：在RA中，发炎滑膜中的显性T细胞克隆在血液中基本不存在，跨组织重叠低至4%，而同一患者的不同关节间却一致共享相同的克隆。这种模式超出了经典的自身免疫范畴；在移植物抗宿主病（一种组织靶向性炎症的同种免疫模型）中进行系统的多组织TCR测序发现，血液和脾脏只捕获了组织库的一小部分，组织间的解剖邻近性是比疾病状态更强的库组成决定因素。在淋巴器官中，疾病相关的克隆扩增可以在临床发作之前出现并持续存在，这表明引流淋巴结中发生的库动态是血液采样完全无法捕捉到的。除了空间区室化，库也是时间动态的。早期RA滑膜由少数高度扩增的私有克隆主导，随着疾病确立而收缩，高度扩增的克隆在早期疾病中占测序TCRs的56%，而在已建立的RA中仅占9.8%。在幼年特发性关节炎中，显性的调节性和常规T细胞克隆被发现同样是区室化和持久的，支持了抗原偏斜库结构的概念。类似地，在系统性硬化症和多发性硬化症中，抗原驱动的克隆已被证明能在数年内以高频率持续存在，表明组织驻留和循环的自身反应性群体是由持续的抗原刺激维持的。这些动态的相关性延伸到其他免疫介导的疾病：心血管疾病越来越被认为具有免疫成分，与此一致，Le Gouge等人识别出一个与心肌梗死后一年心脏功能结局相关的外周血TCR特征，尽管在库多样性或基因使用方面没有主要的全局差异；这种关联背后的抗原特异性和机制仍未解决。因此，理解疾病发病机制需要在靠近炎症的组织部位以及反映疾病相关阶段的时间点进行超出血液的采样。

3.5 公共克隆型和库共享

公共克隆型定义为在个体间检测到的相同或高度相似的TCR序列，是TCR库结构的一个反复出现但数量有限的特性。个体间的精确重叠通常很低，即使分析了数百万个克隆型，通常也只占TCR序列的不到1%，这反映了V(D)J重组的巨大多样性和私有克隆型的主导地位。尽管如此，这个小的共享部分在生物学和分析上都很重要。它们在高生成概率、丰富或持久的克隆以及由趋同重组或共享选择压力塑造的受体中富集，而不一定反映共享的抗原暴露。在无关个体中，Shugay等人报告，当库被深度测序时，在氨基酸水平上存在广泛的共享，在最大测序深度下，每对个体之间共享约72,000个氨基酸一致的CDR3变体，而对于相同配对，在核苷酸水平上仅有约6000个。这种显著的差异表明，相同的氨基酸序列经常通过不同的核苷酸重排产生，支持了趋同重组的概念，即相同的CDR3氨基酸序列可以通过多次独立的、有时是概率上有利的重组事件产生。双胞胎研究进一步说明了共享遗传约束与个性化免疫历史之间的平衡。Zvyagin等人发现，对于TCRβ链和TCRα链，V基因区段的使用在同卵双胞胎对内部比在无关个体之间更相似，包括在读码框外的序列中，这表明遗传背景可以在胸腺选择之前影响重组。J基因使用在重组阶段显示出较弱的遗传决定，而Jα使用在胸腺选择后在同卵双胞胎中变得更加相似，这与MHC依赖的TCRα链塑造一致。然而，即使是遗传上相同的个体也保留着高度个性化的免疫反应：在黄热病疫苗接种研究中，同卵双胞胎中疫苗应答的TCR库显示出趋同特征但有限的精确共享，每个个体产生一个大部分私有的、由数百到数千个反应性克隆型组成的集合。这些观察对自身免疫疾病具有重要意义。公共的自身免疫相关克隆型可能存在，特别是当患者共享HLA等位基因或疾病相关抗原时，然而它们的检测因稀疏采样、私有克隆扩增和个体间总体低重叠而变得复杂。检测此类克隆型进一步因需要结合克隆频率、采样深度和稀有私有序列的长尾来解释库共享而变得复杂。因此，公共克隆型代表了更广泛抗原驱动景观的可检测部分，而大部分疾病相关信号可能隐藏在低频、私有或结构相似的克隆型中，这一差距可能开始被新兴的克隆型聚类、基序检测和抗原预测方法所填补。

3.6 抗原驱动选择的证据和生物标志物潜力

抗原驱动选择可以在TCR库中留下可检测的特征，然而这些特征通常是微妙的、稀疏的，并且仅分布在总库的一小部分中。在实践中，疾病相关的克隆型可能只代表所有观察序列中的一小部分，使得它们的检测成为一个大海捞针的问题。这个问题在自身免疫疾病中尤其相关，因为相关的T细胞反应可能是私有的、组织富集的，或者在外周血中仅微弱扩增。因此，单一库特征很少足以用于可靠的诊断或分层，而整合克隆扩增、序列相似性、V/J基因使用、CDR3基序、理化性质和库级汇总统计的多特征或集成方法越来越受欢迎。尽管存在这些局限性，库特征仍可携带临床上有用的信号。在一项关于病毒暴露的开创性研究中，Emerson等人展示了TCR库特征可以识别巨细胞病毒暴露史并揭示HLA介导的对库组成的影响，支持了抗原历史编码在循环TCR库中的更广泛概念。尽管感染相关的信号通常比自身免疫信号更强、更公共，但这项工作为使用库级信息推断免疫暴露、疾病状态或临床轨迹提供了一个概念框架。基于这一概念，机器学习方法被用于提取自身免疫背景下的疾病特异性TCR特征。Liu等人从877名患者中识别出198个SLE相关的TCRβ克隆型，实现了近乎完美的分类准确性，而Rawat等人使用深度学习识别了在外周血和胰腺引流淋巴结中都富集的T1D相关CDR3基序，为基于TCR的诊断提供了潜在基础。自身免疫库的形成不仅受外周抗原暴露的影响，还受选择前重组偏倚和胸腺选择的影响，后者决定了哪些潜在的自身反应性克隆进入成熟的T细胞池。实验和概念工作表明，成熟的TCR库被选择约束和MHC识别所划分，CDR3序列特征影响哪些受体能存活下来通过选择。这种胸腺组分可能对自身免疫疾病尤其相关。最近的工作进一步表明，胸腺选择可能因性别而异，女性库显示出与自身免疫相关的TCR特异性的富集，为性别偏倚的自身免疫易感性提供了一个潜在机制。总之，基于库的生物标志物对自身免疫疾病具有巨大前景。最稳健的方法需要将抗原驱动选择的生物学知识与统计学严谨的分析、纵向采样、组织感知的研究设计以及可解释的机器学习模型相结合。

4 主要局限性

尽管在适应性免疫受体库测序和分析方面取得了重大进展，但若干局限性仍然制约着TCR库数据在自身免疫疾病中的解读。这些局限性既有技术性的也有生物性的。在实践中，对自身免疫库的研究受到方法学变异性、对相关免疫区室的不完全采样、对抗原特异性的有限获取以及队列异质性的影响。总之，这些问题有助于解释为什么许多发现在不同研究之间难以比较，以及为什么转化为临床有用的生物标志物尚未实现。

4.1 技术偏倚

该领域的首要局限是在实验和计算流程的每一步引入的实质性变异性。TCR库数据集可能因样本处理、核酸来源、扩增策略、测序平台、测序深度和下游生物信息学处理的不同而产生差异。因此，在研究间观察到的差异可能既反映方法学的异质性，也反映疾病相关的生物学。TCR库受起始材料类型的影响，包括全血、外周血单个核细胞、分选的T细胞或组织。输入材料的量、样本质量、冷冻保存程序和细胞分选策略都可能影响哪些克隆型被捕获及其丰度。基于RNA和基于DNA的方案的选择也具有重要后果。基于DNA的方法可能更好地反映细胞水平的克隆频率，而基于RNA的方法可以为表达的TCRs提供更高的灵敏度，尤其是在低输入样本中，但代价是丰度估计会受到转录活性的影响。TCR库也可能受到扩增和测序偏倚的影响。多重PCR、5' RACE方法和其它文库制备策略在其灵敏度、V/J覆盖度、对引物偏倚的敏感性以及回收低频克隆型的能力方面各不相同。当比较那些报告V/J使用、CDR3长度分布或克隆扩增变化的研究时，这些差异尤其成问题，因为这些特征可能受到技术选择的强烈影响。在自身免疫疾病中，疾病相关的信号往往是微妙的，并且可能涉及总库的一小部分，即使是微小的技术扭曲也可能严重影响生物学解释。分析变异性进一步使解读复杂化。库指标取决于克隆型的定义、测序错误的处理、单例的处理、归一化策略以及多样性指数的选择。不同的软件管道即使应用于相同的原始数据，也可能对克隆型丰度、多样性、趋同性或共享性产生不同的估计。同样，V、D和J基因的注释以及对模糊分配的处理也会改变库的表观结构。当试图比较公共数据集或构建包括多疾病比较的多队列研究时，这个问题变得尤为重要。该领域已经朝着标准化做出了重要努力，特别是通过社区指南、基准测试研究和生物学对照。然而，完全的协调统一仍未完成，许多已发表的研究仍然依赖于在获取和分析上存在显著差异的工作流程。这种技术变异性在自身免疫中尤其成问题，因为相对于更广泛的免疫历史、年龄、感染和治疗暴露背景，库的改变往往是比较温和的。

4.2 生物学采样偏倚

即使技术变异性被最小化，库研究仍然受到一个更根本问题的制约：实际上只采样了总T细胞库中非常小的一部分。在自身免疫疾病中，这一局限性至关重要，因为最相关的克隆型可能是稀有的、空间受限的或短暂扩增的。因此，被测序的库并不是免疫反应的完整代表，而是一个由采样深度、输入材料、生物区室和时间点塑造的快照。这个问题首先是数量上的。只有一部分循环或组织驻留的T细胞被收集，而这些细胞中只有一部分被测序。稀有克隆型特别容易受到欠采样的影响，这可能导致对多样性、克隆结构和库重叠的估计不稳定。这在大的血液样本中已经是一个问题，在小活检、分选的亚群和单细胞实验中变得更加严重。在这样的设定下，数据集中某个克隆型的缺失不能被解释为其真正生物学缺失的证据。然而，局限性不仅是数量上的，也是解剖学和时间上的。在许多自身免疫疾病中，血液是最易获取的区室，因此也是最常被研究的。然而，外周血可能不完整地反映发生在组织和引流淋巴结中的疾病相关免疫过程。组织限制性克隆可能在血液中被稀释，而循环克隆可能不是局部病理的主要驱动因素。这种脱节在器官特异性自身免疫疾病中尤其重要，但也可能适用于全身性疾病，其中致病性克隆可能随着时间的推移在各个区室之间重新分布。时间采样增加了另一层不确定性。自身免疫疾病是动态的，具有发作、缓解、慢性低度炎症和治疗诱导重塑的阶段。一个在疾病某一阶段高度相关的克隆型可能在另一阶段检测不到。缺乏患者分层因此可能冒着将疾病相关变异与与致病过程本身无关的瞬时免疫波动相混淆的风险。这个问题被这样一个事实放大了：TCR库受到许多除了自身免疫之外的暴露的影响，包括感染、疫苗接种、衰老和更新。总之，生物学采样偏倚意味着自身免疫TCR库数据集应被解释为疾病相关免疫的部分、区室依赖和时间依赖的观点，而不是致病性T细胞反应的详尽图谱。

4.3 特异性鸿沟

TCR库分析的一个核心