功能性验证一种新型纯合 TTN 剪接位点变异揭示肥厚型心肌病中的异常剪接

《HUMAN MUTATION》：Functional Validation of a Novel Homozygous TTN Splice-Site Variant Reveals Aberrant Splicing in Hypertrophic Cardiomyopathy

　　

TTN 基因编码心肌肌节内的一种关键结构蛋白，其变异可能与肥厚型心肌病（HCM）和扩张型心肌病有关；然而，表型和基因型有所不同。研究人员对一例诊断为 HCM 的中国先证者进行了全外显子组测序（WES）。采用计算机剪接预测工具和 minigene 分析来评估所鉴定变异对 mRNA 剪接的影响。通过文献回顾检索并分析了既往报道的与 HCM 相关的 TTN 基因剪接变异。一例 42 岁男性先证者表现为非梗阻性 HCM 和阵发性房性心律失常。发现一个新的纯合 TTN 变异，预测会导致剪接受体位点处 14 个碱基对缺失。两名无症状后代被发现携带杂合变异。根据变异解读指南，该变异符合 PM2_supporting 标准，被归类为意义未明变异（VUS）。预测的异常剪接效应随后通过 minigene 剪接分析得到证实，表明 pre-mRNA 剪接改变导致框内插入/缺失（p.Arg32498_Glu32504delinsGln）。功能验证证实该突变符合 PM4 标准，提示其可被重新分类为温性 VUS（评分 3 分）。该功能结果可能提供致病性证据。研究人员还回顾了既往报道的 28 个与 HCM 相关的 TTN 剪接变异。其中，57.1%（16/28）定位于 I-band 区域，而 21.4%（6/28）位于肌联蛋白的 A-band 结构域。值得注意的是，21.4%（6/28）与其他肌节基因（MYH7 或 MYBPC3）的致病变异共存，与更严重的临床表型相关。对变异的重新分类和重新解读显示，无一达到可能致病或更高等级。本病例提供了一个纯合剪接位点变异，并经实验证实了异常剪接和肌联蛋白中的框内蛋白改变。本报告的重点是先证者心肌病表型的孟德尔遗传基础，研究数据为特定 TTN 剪接缺陷在 HCM 中的可能作用提供了额外的病例水平和功能证据。

《功能性验证一种新型纯合 TTN 剪接位点变异揭示肥厚型心肌病中的异常剪接》论文解读

肥厚型心肌病（HCM）是最常见的遗传性心肌病，以左心室肥厚为主要特征，患病率约为 1/200。HCM 通常呈常染色体显性遗传，约 60% 的患者携带致病性变异，主要位于编码心肌肌节蛋白的基因中，其中 MYH7 和 MYBPC3 变异占比超过 50%。临床基因组资源（ClinGen）依据证据强度对 HCM 相关基因进行分类，MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TMP1、MYL2、MYL3 和 ACTC1 等被列为“明确”证据，而 TTN 目前仅被列为“有限”证据。肌联蛋白（titin）是肌节中重要的多结构域蛋白，维持肌节结构完整性和被动张力，并调节主动收缩力产生。TTN 是扩张型心肌病（DCM）最常见的明确致病基因，约占 25% 的病例，但 TTN 与 HCM 的关联证据有限且存在争议。既往在 HCM 病例中检出的 TTN 剪接变异多缺乏功能性验证，其致病性难以判定。为此，研究人员报道了一例中国 HCM 家系中的纯合 TTN 剪接位点变异，并通过 minigene 实验验证其对剪接的影响，旨在为 TTN 在 HCM 遗传基础中的作用提供更加充分的证据。

该研究发表于《HUMAN MUTATION》。研究对象为一例 42 岁男性先证者，因反复胸闷、心悸就诊，经心电图、超声心动图、胸部 CT 及实验室检查确诊为非梗阻性 HCM 合并阵发性房颤/房扑。全外显子组测序（WES）发现其携带一个新的纯合 TTN 变异（chr2:g.179406300_179406313del；NM_001267550.2：c.97493-2_97504del），位于剪接受体位点区域，对应 meta 转录本外显子 350（LRG 外显子 351），编码 A-band 区域的 FN-III 125 结构域。该外显子在心肌转录本中高度包含，PSI 值在 DCM 左心室组织中为 100%，在 GTEx 左心室组织中为 98%。家系筛查显示先证者妻子为野生型，两名无症状后代（18 岁儿子和 14 岁女儿）为杂合携带者，符合常染色体隐性遗传模式。根据 ACMG/AMP 指南，该变异最初依据 PM2_supporting 标准被归类为意义未明变异（VUS）。

研究人员采用多种技术方法开展研究。对先证者外周血 DNA 进行 WES，并使用 Sanger 测序验证变异及家系共分离。利用 RDDCSC、VarSEAK 和 SpliceAI 等生物信息学工具预测剪接影响，其中 SpliceAI 预测破坏剪接受体位点（Δscore 0.99）。随后构建包含 TTN 外显子 349、内含子 349 和外显子 350 的 pcMINI 重组质粒，转染 HEK293T 和 HeLa 细胞，通过 RT-PCR 和 Sanger 测序分析剪接产物。此外，系统检索 PubMed、ClinVar 和 HGMD 数据库，收集并重新解读所有已报道的 HCM 相关 TTN 剪接变异。

研究结果分为以下几个部分。第一，临床和随访结果：先证者表现为非梗阻性 HCM 伴保留的左室射血分数（58%），心电图提示 2:1 房扑，24 小时心电监测发现阵发性房颤和室上性心动过速；随访期间室间隔持续增厚，左室后壁厚度和左房内径减小。第二，鉴定纯合 TTN 剪接位点变异：WES 与 Sanger 测序确认先证者为纯合 14 bp 缺失，变异位于剪接受体位点，影响 A-band 区域的 FN-III 125 结构域；其妻子为野生型，子女为杂合携带者。第三，剪接效应验证：minigene 实验表明该变异未导致外显子跳跃，而是激活了一个位于真实接受位点下游 18 bp 的隐蔽剪接位点，产生框内插入/缺失变异（c.97493_97510del；p.Arg32498_Glu32504delinsGln）。这一结果符合 ACMG/AMP 的 PM4 证据标准，支持将该变异重新分类为温性 VUS（评分 3 分）。第四，文献综述：共收集 28 个与 HCM 相关的 TTN 剪接变异，其中 57.1%（16/28）位于 I-band 区域，21.4%（6/28）位于 A-band 区域；21.4%（6/28）与 MYH7 或 MYBPC3 的致病变异共存，且与更严重的临床表型（如不明原因晕厥、心源性猝死、非持续性室速）相关。经 ACMG/AMP 指南重新分类，46.4%（13/28）为 VUS，53.6%（15/28）为可能良性或良性，无一达到可能致病或更高等级。

讨论部分指出，TTN 变异在 DCM 中的致病性明确，但在 HCM 中的作用仍存在争议。本研究所报道的纯合 TTN 剪接变异通过激活隐蔽剪接位点产生框内改变，并非典型的截短变异，但其影响 A-band 区域高度保守的 FN-III 结构域，且纯合状态下可能与 HCM 表型相关。既往小鼠模型和功能研究也支持 TTN 参与 HCM 的生物学合理性，例如 PEVK 敲除小鼠出现舒张功能障碍和心脏肥大，M-line 缺陷小鼠出现心脏肥大和心衰。虽然该变异经功能验证后仍为温性 VUS，但根据 ESC 共识，其管理应主要基于先证者表型、遗传模式及家族再评估。本研究的局限性在于未能获得患者来源的 RNA 进行内源性剪接验证，也未能获得父母及兄弟姐妹的样本进行更广泛的家系共分离分析。

结论部分指出，该研究首次描述了一个与纯合 TTN 变异相关的中国 HCM 家系。minigene 实验证明该缺失导致 pre-mRNA 异常剪接，在 FN-III 结构域内产生复杂框内插入/缺失（c.97493_97510del；p.Arg32498_Glu32504delinsGln），可能与较轻的 HCM 表型有关。尽管单个变异无法完全阐明基因型与表型的对应关系，但本研究结果为 HCM 的分子遗传机制提供了新的见解，并为 TTN 剪接变异在 HCM 中的可能作用增加了病例水平和功能证据。