茶源表没食子儿茶素没食子酸酯延缓小鼠排卵后卵母细胞衰老

《Food Science & Nutrition》：Epigallocatechin Gallate From Tea Delays Oocyte Aging After Ovulation in Mice

　　

摘要翻译：
在临床上，一旦排出的卵母细胞未能及时受精，便会开始发生排卵后老化，进而影响胚胎发育和后代健康。迄今为止，尚缺乏有效手段来延缓排卵后卵母细胞老化。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）是茶多酚中含量最丰富的生物活性成分，有助于减轻环境因素对卵母细胞质量的有害影响。本研究在体外探讨了EGCG延缓排卵后卵母细胞老化的作用。研究人员将排卵后卵母细胞暴露于不同浓度的EGCG中，结果显示50 μM的EGCG可显著降低老化诱导的卵母细胞碎片化率。为进一步阐明EGCG对排卵后老化卵母细胞质量的影响，研究人员检测了老化卵母细胞的纺锤体形态，结果表明EGCG显著降低了排卵后老化卵母细胞纺锤体形态异常率。EGCG还改善了排卵后老化卵母细胞中升高的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平及线粒体功能障碍，这可能是其减少细胞凋亡的原因之一。老化卵母细胞降低的精子结合能力也因添加EGCG而得到提高。这些结果表明，EGCG能够改善排卵后老化卵母细胞的质量。

**论文解读：EGCG延缓小鼠排卵后卵母细胞老化的研究**

**研究背景与问题**
卵母细胞质量受慢性疾病、环境污染物、年龄及基因突变等多种因素影响，其下降可导致临床上的亚生育力或不孕。排卵后的成熟卵母细胞若未能在最佳受精窗口内受精，即开始发生排卵后老化（post-ovulatory aging）。随着老化进程，卵母细胞发育潜能显著降低，表现为受精率下降、线粒体功能障碍、纺锤体形态及染色体组织异常、活性氧（ROS）堆积加剧，以及胚胎发育能力受损。此外，老化卵母细胞还会对后代健康产生不良影响，如精神异常、多动、生育力降低和寿命缩短。因此，在临床上延缓排卵后卵母细胞老化至关重要。茶作为中国传统饮品，其健康益处已被大量研究证实，茶多酚占茶叶干重的30%–40%，是茶叶中最主要的生物活性成分。EGCG作为茶多酚中含量最丰富的生物活性成分，具有抗氧化、清除自由基及调节酶活性等功能。已有研究表明EGCG能改善母体糖尿病对小鼠卵母细胞质量的不利影响，并提高猪卵母细胞受精率及胚胎发育能力，但EGCG在延缓排卵后卵母细胞老化中的作用尚不明确。基于此，研究人员开展了本研究，旨在评估EGCG对体外老化卵母细胞质量的改善作用。

**研究内容与结论**
研究人员以ICR小鼠为模型，获取排卵后MII期卵母细胞，在体外建立老化模型（老化24 h或48 h），并添加不同浓度（0、25、50、75、100 μM）的EGCG进行处理。主要从卵母细胞碎片化率、纺锤体形态、线粒体膜电位、ROS水平、细胞凋亡、精子结合能力及胚胎发育潜能等方面评估EGCG的效果。结果表明，50 μM EGCG能显著降低老化卵母细胞的碎片化率，改善异常纺锤体形态，恢复线粒体膜电位，降低ROS蓄积，抑制凋亡，并提高精子结合能力和胚胎发育率。机制方面，EGCG可能通过激活NRF2-KEAP1抗氧化系统上调Sod2表达，从而减轻氧化应激；同时EGCG还恢复了自噬相关基因Atg7的表达水平。

**主要技术方法**
本研究采用了多种实验技术，包括：小鼠超数排卵与卵母细胞收集（使用孕马血清促性腺激素PMSG和人绒毛膜促性腺激素hCG处理雌性ICR小鼠）；体外老化培养（M16培养基中添加EGCG）；体外受精（HTF培养基中精子获能与受精，KSOM中培养胚胎）；免疫荧光染色（抗α-微管蛋白FITC抗体标记纺锤体，DAPI/PI标记DNA）；JC-1染色检测线粒体膜电位；DCFH-DA荧光探针检测ROS水平；Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡；实时荧光定量PCR（qPCR）检测基因表达。样本来源于济南朋悦实验动物繁育有限公司提供的SPF级ICR小鼠。

**研究结果**
**3.1 EGCG降低排卵后老化卵母细胞的碎片化率**
研究人员在老化培养基中添加不同浓度EGCG，发现老化24 h和48 h后，50 μM EGCG均能显著降低卵母细胞碎片化率，表明EGCG可有效延缓排卵后卵母细胞老化。

**3.2 EGCG改善老化卵母细胞的异常纺锤体形态**
通过免疫荧光染色观察纺锤体形态，结果显示，排卵后老化显著增加纺锤体异常率，而添加50 μM EGCG后，异常率显著下降，说明EGCG能够恢复老化对纺锤体形态的不良影响。

**3.3 EGCG恢复老化卵母细胞的线粒体膜电位**
采用JC-1染色检测线粒体膜电位，发现老化卵母细胞红/绿荧光比值显著低于新鲜组，而EGCG处理后该比值明显回升，表明EGCG可修复老化导致的线粒体功能障碍。

**3.4 EGCG降低老化卵母细胞的ROS水平并通过NRF2-KEAP1通路发挥作用**
DCFH荧光探针检测显示，老化卵母细胞ROS水平显著高于新鲜组，EGCG处理后ROS水平显著下降。qPCR结果显示，老化卵母细胞中Sod2、Keap1、Nrf2表达降低，EGCG可显著上调这些基因的表达。此外，使用NRF2-KEAP1激活剂ML334处理老化卵母细胞可同样降低ROS水平并上调Sod2表达，提示EGCG可能通过NRF2-KEAP1抗氧化系统减轻氧化应激。

**3.5 EGCG抑制老化卵母细胞的凋亡并上调Atg7表达**
Annexin-V染色显示，老化卵母细胞荧光信号增强，EGCG处理后显著减弱。qPCR检测发现，老化卵母细胞中自噬相关基因Atg7表达下调，EGCG处理可显著恢复其表达，提示EGCG可能通过调节自噬来抑制凋亡。

**3.6 EGCG提高老化卵母细胞的精子结合能力和胚胎发育潜能**
精子结合实验显示，老化卵母细胞的精子结合能力显著低于新鲜组，EGCG处理后显著提高。将受精卵体外培养108 h后，老化组的卵裂率和囊胚率均显著降低，而EGCG处理可明显改善这两项指标，表明EGCG能提升老化卵母细胞的受精及胚胎发育能力。

**讨论与结论**
讨论部分指出，氧化应激是哺乳动物卵母细胞排卵后老化的关键起始因素，ROS蓄积可导致DNA损伤和凋亡。本研究证实EGCG可显著降低老化卵母细胞中的ROS水平，这与EGCG激活NRF2-KEAP1抗氧化系统、上调Sod2等抗氧化酶表达密切相关。同时，EGCG改善了线粒体功能，进而减少纺锤体异常。此外，老化导致的透明带（ZP）硬化会影响精子结合，而EGCG处理显著增强了精子与老化卵母细胞的相互作用，可能通过抑制ZP2过早切割来实现。研究结论认为，EGCG在体外能够有效改善排卵后老化卵母细胞的质量，但其临床转化仍需进一步的体内实验及更深入的机制研究。