嘌呤能受体P2Y2调控斑马鱼脊髓损伤后的神经发生与功能恢复

《The FASEB Journal》：Purinergic Receptor P2Y2 Regulates Neurogenesis and Functional Recovery Following Spinal Cord Injury in Zebrafish

　　

与哺乳动物不同，成年斑马鱼（Danio rerio）在脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后可进行神经元再生，从而成功实现功能恢复。斑马鱼对SCI的适应性再生反应包括损伤诱导的室管膜放射状胶质细胞（ependymal radial glial cells, ERGs）增殖和神经发生。在斑马鱼等“再生能力较强”的物种中，损伤诱导神经发生的分子机制尚未完全阐明，且是备受关注的领域。在哺乳动物中，嘌呤能受体P2Y2已被证明可介导神经干细胞（neural stem cell, NSC）增殖和神经发生，但其在SCI后或斑马鱼中的潜在作用尚不清楚。本研究发现，成年斑马鱼SCI后P2Y2表达失调，且药物抑制P2Y2在损伤后2周降低游泳能力。尽管P2Y2表达于活跃增殖的ERGs，但该受体的拮抗作用并未影响其增殖水平。然而，P2Y2抑制确实减弱了SCI诱导的神经发生，且P2Y2在成年斑马鱼未成熟和成熟神经元中强表达。总体而言，P2Y2在损伤诱导的神经发生过程中作为促神经发生因子发挥作用，并有助于成年斑马鱼游泳行为恢复。

该研究发表于《The FASEB Journal》。脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种复杂且治疗选择有限的疾病，常导致损伤平面以下感觉、自主和运动功能严重且不可逆的丧失。损伤后的细胞反应始于广泛的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）释放，继而诱发兴奋性毒性钙（Ca²⁺）变化和细胞凋亡。哺乳动物脊髓损伤后形成的不利微环境会阻碍神经元替代和轴突再生，使干细胞移植等治疗策略效果受限。与哺乳动物不同，成年斑马鱼在脊髓损伤后能够进行广泛的内源性神经发生，并在约6周内实现功能恢复。这种适应性再生反应主要依赖于沿脊髓中央管排列的室管膜放射状胶质细胞（ependymal radial glial cells, ERGs），损伤后ERGs增殖约在7天达峰，神经元产生约在14天达峰。嘌呤能信号系统在进化上高度保守，其中P2Y2受体在哺乳动物中可调节神经干细胞（neural stem cell, NSC）增殖和神经发生，并参与神经营养因子介导的神经元分化；然而，P2Y2在斑马鱼脊髓损伤后的作用尚不清楚。该研究旨在探讨P2Y2在成年斑马鱼SCI后损伤诱导神经发生和功能恢复中的作用。

研究人员以成年野生型Tübingen（TU/TL）斑马鱼为模型，通过脊髓完全横切手术建立SCI模型，并使用P2Y2特异性竞争性拮抗剂AR-C118925XX进行腹腔注射，结合行为学分析、蛋白质定量、转录组分析和免疫组织化学，系统评估P2Y2对损伤后ERGs增殖、神经元生成和游泳功能恢复的影响。结果显示，P2Y2在SCI后表达失调；抑制P2Y2损害游泳能力并减少损伤诱导的神经发生，但不影响ERGs增殖。该研究揭示了P2Y2作为促神经发生因子的新作用，为理解再生物种的损伤诱导神经发生机制提供了重要见解，并可能为SCI治疗提供新的分子靶点。

主要关键技术方法包括：成年斑马鱼脊髓完全横断手术模型；腹腔注射P2Y2特异性拮抗剂AR-C118925XX（1 mg/kg）实现慢性受体抑制；开放场、尾触刺激和游泳隧道力竭实验评估功能恢复；Western blot检测脊髓组织P2Y2蛋白表达；利用已发表的斑马鱼脊髓RNA-seq数据集进行转录组分析；免疫组织化学结合增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）和泛神经元标记物HuC/D染色，定量中央管周围PCNA⁺细胞和HuC/D⁺神经元数量。动物样本来自麦克马斯特大学和圭尔夫大学动物设施饲养的成年野生型斑马鱼，RNA-seq数据源自公开数据集（PRJNA758278/GSE182911）。

主要研究结果如下：

P2Y2在成年斑马鱼脊髓损伤后表达失调。通过Western blot检测到斑马鱼脊髓中P2Y2存在50 kDa和25 kDa两种异构体；50 kDa异构体在损伤后7天（7 days post-injury, dpi）于损伤区及其头侧、尾侧均显著上调，至14 dpi和21 dpi恢复至基础水平。25 kDa异构体在损伤后早期维持基础水平，但在21 dpi出现显著下调。利用公开RNA-seq数据集分析发现，编码P2Y2的三个基因p2ry2.1、p2ry2.2和p2ry2.3在7 dpi和14 dpi的转录水平均无显著变化，提示蛋白表达变化可能受到翻译后修饰调控。

P2Y2受体抑制影响功能恢复。行为学检测显示，在开放场总运动距离、尾触刺激后的平均身体角度变化以及头侧代偿比值方面，AR-C处理组与盐水对照组在14 dpi和21 dpi均无显著差异。但在游泳隧道力竭实验中，AR-C处理组在14 dpi的力竭时间显著短于盐水对照组，表明P2Y2抑制降低了损伤后早期的游泳能力；至21 dpi，即停止给药7天后，两组差异消失。

P2Y2受体活性不影响损伤后神经干细胞增殖。免疫组织化学显示，P2Y2与增殖标记物PCNA在中央管周围细胞中共定位，表明P2Y2表达于活跃增殖的ERGs。但在7 dpi，AR-C处理组的中央管周围30 μm范围内PCNA⁺细胞数量与盐水对照组无显著差异，且距离损伤区的远近效应不受处理影响。两组损伤后增殖均显著高于未损伤对照组。这说明P2Y2虽然存在于增殖细胞上，但并不驱动损伤诱导的ERGs增殖。

P2Y2受体抑制减少损伤诱导的神经发生。P2Y2与泛神经元标记物HuC/D在未损伤脊髓的成熟神经元中明显共定位，在14 dpi的未成熟和成熟神经元中也有强共定位。定量分析显示，AR-C处理可显著降低损伤区头侧和尾侧HuC/D⁺细胞数量，尤其在靠近损伤区的位置效应最明显；但两组损伤后神经元数量仍显著高于未损伤对照。这表明P2Y2信号有助于损伤诱导的神经元产生。

讨论部分指出，哺乳动物SCI后P2Y2蛋白表达变化模式与斑马鱼不同，且斑马鱼中P2Y2蛋白表达改变未伴随转录改变，提示翻译后修饰可能参与调控。P2Y2不驱动ERG增殖，损伤后ERGs增殖可能由P2X7等其他嘌呤能受体介导。P2Y2可能通过SRC介导的TrkA受体转激活或IP₃/钙信号通路促进神经分化。P2Y2抑制对游泳能力的早期影响提示其还可能参与胶质桥形成和轴突再生等其他再生过程。研究结论部分指出，嘌呤能信号系统在脊髓损伤后的功能相对未知，但似乎发挥着可能影响细胞再生的重要作用。该系统进化保守，使“非再生”哺乳动物模型与天然“再生”物种如斑马鱼之间能够进行跨物种比较。阐明P2Y2等嘌呤能因子如何调控斑马鱼成功再生中的重要过程，包括ERG增殖和神经发生，将有助于揭示再生允许性微环境所必需的条件，并突出哺乳动物中存在的关键差异。最终，该研究表明P2Y2信号参与脊髓损伤后的适应性反应，并可能成为未来治疗策略的重要靶点。