通过荧光相关技术实现快速无细胞抗体片段生产与结合分析

《Methods》：Rapid cell-free antibody fragment production and binding analysis via fluorescence correlation

　　

# 摘要

本研究提出了一种工作流程，用于利用基于大肠杆菌（*E. coli*）的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统快速生产和功能表征抗体片段。我们利用荧光相关光谱（FCS）定量测定结合相互作用，从而实现了对抗体与SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）之间解离常数（????）的测定。作为初步验证，我们对两种常规表达的抗RBD抗体进行了分析，以建立基于FCS的结合测定的可靠性。为了实现高效的无细胞生产，我们开发了提高单链可变片段（scFvs）溶解度和产量的策略，包括实施一种经改造以适应CFPS衍生蛋白的既定两阶段复性工作流程。该方法使我们能够从不溶组分中回收具有功能的scFvs。此外，我们成功生产并表征了Fab片段，结合测定证实了抗原识别能力的保留。综合来看，这些结果表明，CFPS可以与FCS结合，实现对抗体片段结合的 rapid、液相评价，而无需依赖传统的基于细胞的表达系统。该整合平台为抗体筛选和表征提供了一种可扩展的方法，在 therapeutic 抗体开发和高通量发现中具有潜在应用。

# 引言

COVID-19大流行凸显了快速、高效蛋白质生产方法的迫切需求，特别是对于疫苗和治疗性抗体的开发而言。传统的蛋白质表达系统，例如哺乳动物细胞瞬时转染，通常需要大量时间和资源，这可能会延迟关键治疗药物的开发 [1], [2], [3]。为了应对这一挑战，无细胞蛋白质合成（CFPS）已成为一种有前景的快速、灵活蛋白质生产和筛选方法。CFPS系统，包括基于大肠杆菌（*E. coli*）和中国仓鼠卵巢（CHO）裂解液的系统，消除了细胞生长和维护的需求，与传统的基于细胞的方法相比，能够实现更快的筛选和迭代生产 [4], [5], [6], [7], [8]。CFPS以裂解液形式保留了细胞内的蛋白质生产机制，能够在体外进行蛋白质合成而不受细胞存活性的限制 [5], [9], [10]。基于大肠杆菌的裂解液因其成本效益高和产量大而得到广泛应用 [9]，而真核裂解液，如来源于CHO细胞的裂解液，能够实现需要翻译后修饰的复杂蛋白质的生产 [9], [10], [11], [12]。然而，真核系统通常效率较低且成本更高 [9]。

抗体在therapeutic和诊断应用中发挥着关键作用，单链可变片段（scFvs）和Fab片段因其体积较小、稳定性高且易于工程化而具有显著优势 [11], [12], [13], [14]。已开发了多种抗体片段格式用于重组设计和生产。这些包括可变重链域（VHH），它构成了重链-only 抗体的结合部分 [15]；scFvs，它们是最小的重组抗体片段，保留了原始抗体的抗原结合域 [16]；以及Fab片段，它们包含完整的抗原结合区域，且结构上比scFvs更接近IgG [17], [18]。尽管具有这些优势，scFvs通常难以以可溶且有功能的形式表达，特别是在原核系统中，这可能限制其可扩展性和快速筛选的实用性 [17], [19], [20], [21]。具体而言，从不溶性聚集体中回收单链可变片段的复性已被广泛研究，尤其是在原核表达系统中，不正确的二硫键形成经常导致聚集。Plückthun及其同事的开创性研究 [22] 确立了以包涵体形式表达的scFvs可以通过变性后在定义的氧化还原条件下进行受控复性，从而以有功能的形式高效回收，这强调了免疫球蛋白折叠内在的热力学稳定性，尽管存在动力学折叠障碍。后续工作 [23], [24] 通过优化氧化还原缓冲、稀释和基于透析的工作流程，进一步完善了这些策略，以提高复性产量、可重复性和抗原结合活性的恢复。在此背景下，CFPS提供了一种高效的抗体片段生产平台，能够快速、可扩展地生产有功能的蛋白质 [6], [22], [25], [26]。此外，优化策略，包括伴侣蛋白补充、氧化还原调节和后表达复性方案，已被证明能够提高溶解度并促进从聚集或错误折叠中间体中回收正确折叠和有功能的蛋白质 [24], [27], [28]。

除了快速蛋白质生产外，对抗体-抗原相互作用的定量表征对于therapeutic和诊断开发至关重要。用于确定结合速率的传统技术，如表面等离子体共振（SPR）[29]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[30]，或较新的方法如生物膜层干涉仪（BLI）[31]，可能耗时较长，并且通常需要大量的纯化蛋白。荧光相关光谱（FCS）提供了一种液相方法，可以用最少的样品要求来定量抗体-抗原相互作用。在FCS中，荧光标记的分子扩散通过飞升级检测体积，结合事件通过由于增加的流体力学半径引起的扩散时间变化来检测。这使得能够直接在溶液（包括在复杂环境中，如粗制无细胞裂解液）中确定结合亲和力（K_D）[32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [37], [40], [41], [42], [43]。

本研究将CFPS和FCS整合为一个实用平台，用于抗体片段的快速生产和定量筛选。利用基于大肠杆菌的CFPS系统，我们评估了与人类相关的scFvs和Fab片段，并开发了应对低溶解度和低产量的策略。对于scFvs，首先使用折叠添加剂改善可溶性表达，而对于仍然低溶或不溶的变异体，则采用两阶段复性工作流程作为回收策略。Fab片段被直接表达和表征。这些片段的结合特性使用FCS进行分析，提供了抗原-抗体相互作用的快速液相评估。对于可直接分析的可溶性产物，一旦裂解液和标记抗原可用，CFPS到FCS的工作流程可在一天内完成，而需要复性不溶性scFvs的工作流程可在大约两天内完成 [44]。即使有这一额外的回收步骤，基于CFPS的路径仍然比传统的基于细胞的生产工作流程明显更短且操作更简单。这些发现突出了CFPS和FCS作为互补工具在加速抗体片段开发和筛选方面的潜力。

# 章节片段

## 无细胞表达系统和优化

我们使用了Liu等人之前描述的CFPS方案 [37]。简要而言，ClearColi BL21(DE3)细胞在含1% NaCl的2× YT培养基中培养，用1 mM IPTG诱导，收获，并通过超声裂解。裂解液通过离心澄清，在37 °C下进行30分钟的run-off反应，然后存储在-80 °C。对于CFPS，1 mL规模的反应通过将裂解液（最终体积25%）、质粒DNA和含有1.2 mM ATP、0.86 mM GTP/UTP/CTP、34 μg/mL的反应混合物配制而成。

## FCS测量抗体-抗原结合亲和力

为了验证FCS作为测量抗体-抗原相互作用的定量工具的适用性，我们首先测试了它使用经过充分表征的针对SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）的单克隆抗体检测结合的能力。为此，我们选择了S309 IgG，一种广谱中和抗体，已知以纳摩尔亲和力结合多种RBD变异体 [49]。图2a显示了SDS-PAGE凝胶，确认了Alexa Fluor 488（A488）标记的……

## 讨论

本研究展示了将无细胞蛋白质合成（CFPS）与荧光相关光谱（FCS）结合用于抗体片段生产和功能表征的实用性。该方法的一个主要优势是使用FCS作为敏感的液相方法来测量不同相互作用强度和抗原变异体之间的抗原-抗体结合亲和力。另一个优势是使用CFPS作为抗体……

## 结论

本研究证明了将CFPS和FCS结合用于抗体片段高效生产和表征的有效性。基于大肠杆菌的CFPS系统被证明是产生scFvs和Fab片段的可靠平台，优化策略，如纳入折叠增强剂和两阶段复性方案，显著提高了产量和溶解度。FCS的使用使得能够精确测定结合亲和力，展示了其潜力……

## 利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本文所报告的工作。

## 致谢

作者感谢Sean Gilmore和Brent Segelke对scFv质粒的初始设计和测试；感谢Yaqing Wang、Sun Kyung Kim和Bonnee Rubinfeld提供RBD和全长抗体98蛋白。本项目由劳伦斯利弗莫尔国家实验室实验室主导研发拨款21ERD039资助，并部分由GUIDE和ARPA-H De Novo生物制品设计（DeNOVO；AAH24039）项目支持。本文引用的研究……

Shakiba Nikfarjam | Chao Liu | Emma J. Laurence | Adam N. Laurence | Jennifer L. Chlebek | Dante P. Ricci | Steven A. Hoang-Phou | Isabella M. Carrano | Ted A. Laurence | Matthew A. Coleman

美国加利福尼亚州利弗莫尔94550，劳伦斯利弗莫尔国家实验室，生物科学与工程部