重新审视天冬氨酰葡糖胺尿症的酶替代疗法：截短的磷酸转移酶增强天冬氨酰葡糖胺酶的甘露糖-6-磷酸化与细胞摄取

《Journal of Inherited Metabolic Disease》：Revisiting Enzyme Replacement Therapy for Aspartylglucosaminuria: Truncated Phosphotransferase Enhances Mannose-6-Phosphorylation and Cellular Uptake of Aspartylglucosaminidase

　　

天冬氨酰葡糖胺尿症（AGU）是一种溶酶体贮积症，由天冬氨酰葡糖胺酶（AGA）缺乏引起，该酶是一种参与N-糖基化蛋白降解的水解酶。目前，AGU尚无获批的治疗方法。AGA酶复杂蛋白水解加工和激活过程涉及二聚化和切割为两个亚基，这阻碍了AGU酶替代疗法（ERT）的开发。AGA靶向溶酶体主要通过甘露糖-6-磷酸受体介导的途径实现，且AGA的两个亚基均含有磷酸化的N-聚糖。在本研究中，研究人员开发了一种过表达系统，用于表达优化的人AGA酶和截短的、甘露糖-6-磷酸化所需的GlcNAc-1-磷酸转移酶S1S3。研究发现，共表达S1S3可增强AGA的甘露糖-6-磷酸化和细胞摄取，并且可在HEK293T细胞中表达高水平的亲和标记重组人AGA，并从培养基中纯化。AGA的N-糖基化受损导致细胞摄取不良，表明甘露糖-6-磷酸依赖途径是AGA的主要内吞途径。此外，为获得最佳摄取，AGA的两个亚基均需被糖基化和甘露糖-6-磷酸化。本研究结果增进了对AGA溶酶体靶向机制的理解，并为AGU的ERT开发铺平了道路。

**重新审视天冬氨酰葡糖胺尿症的酶替代疗法：截短的磷酸转移酶增强天冬氨酰葡糖胺酶的甘露糖-6-磷酸化与细胞摄取——论文解读**

天冬氨酰葡糖胺尿症（AGU；OMIM 208400）是一种罕见的遗传性溶酶体贮积症，由天冬氨酰葡糖胺酶（AGA；N4-(β-N-乙酰葡糖胺基)-L-天冬酰胺酶，EC 3.5.1.26）缺乏所致，导致GlcNAc-Asn等N-乙酰葡糖胺类底物在组织和体液中蓄积。自AGU被发现近60年来，仍无因果治疗手段。AGA在粗糙内质网（rER）中以前体形式合成，经二聚化和自催化切割形成有活性的异四聚体α₂β₂形式，随后在溶酶体中进一步加工。AGA向溶酶体的转运主要依赖甘露糖-6-磷酸受体（MPR）介导的途径，其两个亚基均携带磷酸化的N-聚糖。开发酶替代疗法（ERT）的主要障碍包括：重组AGA的复杂蛋白水解加工与激活难以量产；过表达时内源性GlcNAc-1-磷酸转移酶对大量产生的酶蛋白M6P标记不足；以及未加标签的AGA纯化步骤繁琐。因此，需要建立一种能高效产生具有充足甘露糖-6-磷酸（M6P）修饰、并有活性重组AGA的细胞系统。

本研究旨在开发一种AGA过表达系统，从而能够从培养基中大量纯化具有M6P修饰且适用于ERT的活性AGA。研究人员利用HEK293T细胞（包括内源AGA敲除的HEK293T）构建了密码子优化的AGA表达载体，并在C末端引入可切除的Twin-Strep标签或紧接信号肽后引入HQ标签。同时，合成了密码子优化的截短型GlcNAc-1-磷酸转移酶S1S3（来源于前期文献报道的S1S3序列），并与AGA共表达，以增强AGA的M6P磷酸化。研究还构建了α亚基Asn38Gln（N38Q）和β亚基Thr310Ala（T310A）的N-糖基化位点突变体，以评估两个亚基的N-聚糖对磷酸化及细胞摄取的贡献。主要结论包括：亲和标签不干扰AGA的加工、活性和摄取；共表达S1S3可显著提高AGA的M6P含量并增强患者成纤维细胞对重组酶的摄取；N-糖基化位点突变体则显著降低摄取，两个亚基同时失去N-聚糖时摄取几乎完全消失，证明M6P依赖途径是AGA内吞的主要途径。研究为AGU的ERT开发奠定了工艺基础。

研究采用的主要技术方法包括：使用HEK293T及AGA敲除HEK293T细胞进行瞬时/稳定转染；以来自AGUFin-major纯合患者（GM00568）和复合杂合患者（c.280G>C/c.503G>A；p.Gly94Arg/Trp168*）的原代皮肤成纤维细胞为摄取模型；利用Strep-Tactin亲和层析或HQ标签金属亲和层析从培养基纯化AGA，经TEV蛋白酶去除标签；采用荧光底物Asp-AMC测定AGA活性；通过免疫沉淀和Western blot检测M6P修饰、亚基加工；以荧光标记AGA处理患者细胞，结合LAMP1免疫荧光共定位观察溶酶体靶向；用丙戊酸增强蛋白表达；所有实验至少重复三次并采用t检验或方差分析。

研究结果分述如下。

**3.1 重组AGA蛋白表达与纯化**：研究人员设计了C端Twin-Strep标签和N端HQ标签的AGA构建体，在HEK293T细胞中表达后，经Strep-Tactin柱或亲和纯化可从培养基中分离得到重组AGA。Western blot显示，两种标签均不影响AGA前体加工为α和β亚基。TEV蛋白酶可切除Twin-Strep标签，得到与内源AGA几乎一致的重组蛋白。

**3.2 丙戊酸增强AGA蛋白表达**：组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸以剂量依赖方式显著提高培养基中活性AGA的分泌量，而胞内AGA活性基本不变。高浓度丙戊酸使细胞生长受限，故选用8 mM丙戊酸用于后续大规模培养。

**3.3 患者成纤维细胞对重组AGA的摄取**：用纯化Strep标签AGA处理AGUFin-major纯合患者成纤维细胞后，细胞内AGA活性随给药浓度和孵育时间增加而升高，24小时即可达到健康对照约45%的活性，接近AGU携带者水平；孵育65小时后仍保留60%的活性，估算半衰期至少3天。荧光标记AGA与LAMP1阳性酸性细胞器部分共定位（54%±13%），表明重组酶被靶向至溶酶体。

**3.4 重组AGA的甘露糖-6-磷酸化**：通过抗M6P抗体免疫沉淀，证明加工后的成熟AGA携带M6P，而主要定位于rER的前体形式无M6P。在培养基中加入5 mM M6P可完全抑制患者细胞对重组AGA的摄取，证实该摄取依赖M6P/MPR途径。

**3.5 S1S3磷酸转移酶增加AGA的M6P**：将myc标签的S1S3与AGA共表达后，免疫沉淀和Western blot显示AGAα及β亚基上的M6P信号均显著增强。在两种AGU患者成纤维细胞中，共表达S1S3来源的培养基使无标签、Strep标签或HQ标签AGA的细胞摄取率均显著提高，而5 mM M6P竞争可完全消除该增强效应。S1S3不改变AGA的亚基加工或酶活性。

**3.6 两个亚基的N-糖基化对最佳M6P和摄取必不可少**：N38Q（α亚基）或T310A（β亚基）单突变导致相应亚基分子量降低，细胞裂解液中AGA活性下降至约75%，双突变则加工严重受损，活性仅约25%。以等活性培养基处理患者成纤维细胞后，野生型AGA的摄取可被S1S3显著增强，单糖基化突变体摄取基线明显低于野生型，但S1S3仍有一定增强；双糖基化突变体几乎完全丧失摄取能力，且S1S3无效。这表明两个亚基的N-聚糖均可作为M6P介导摄取的底物，但只有两个亚基均被糖基化并磷酸化时才能达到最佳细胞摄取。

讨论部分指出，本工作解决了重组AGA产量和纯化的瓶颈。与内源酶几乎一致的无标签AGA可通过可切除亲和标签获得，从而满足ERT的酶学需求。M6P竞争实验和糖基化突变实验共同证明了AGA的内吞摄取高度依赖M6P，且S1S3共表达是一种提高治疗性溶酶体酶M6P含量的有效策略，已被用于其他溶酶体疾病产品开发。尽管仍需进一步优化生产工艺并在动物模型中验证疗效，该研究是开发AGU患者ERT的重要里程碑。

论文发表于《Journal of Inherited Metabolic Disease》，研究结论可概括为：通过截短的磷酸转移酶S1S3共表达，可显著增强重组AGA的甘露糖-6-磷酸化和细胞摄取，且两个亚基的糖基化均为此过程所必需，为AGU的酶替代疗法开发铺平了道路。正如原文所述，在AGU首次被描述近60年后，我们距离开发AGU的因果治疗又近了一步。