‘计算机标记’：利用智能多模态光学显微镜探索纳米尺度的生物景观

《Journal of Microscopy》：‘In silico labelling’: Exploring the biological landscape at the nanoscale using intelligent multimodal optical microscopy

　　

多模态光学显微镜最近与人工智能（artificial intelligence，AI）融合，实现了计算机标记（in silico labelling）——从无标记测量中计算预测类荧光分子对比。荧光在分子水平连接显微术和光谱学方面发挥着关键作用，通过线性和非线性研究模态实现图像形成。在过去二十年中，荧光光学显微镜已发展为光学纳米显微术和单分子定位方法，在环境条件下可在纳米乃至埃（?ngstrom）尺度工作。受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED）、光激活定位显微术（Photo-Activated Localisation Microscopy，PALM）、随机光学重建显微术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）、超分辨荧光寿命成像显微术（super-resolution fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM）和图像扫描显微术（image scanning microscopy，ISM）、最小荧光光子通量显微术（Minimal Fluorescence photon Flux，MINFLUX）等方法使研究人员能够在分子水平研究活细胞。该领域一个重大且具有挑战性的进展是将荧光与无标记偏振和相位光学方法——例如穆勒矩阵（Mueller-matrix，MM）显微术——耦合，旨在从无标记数据集中提取特定分子信息。在这篇综述中，研究人员讨论了这种融合以及用于计算机标记的现代生成建模，如何将光学显微镜转变为智能仪器。

多模态光学显微镜在生物系统研究中具有重要意义，它能够关联结构、组成、过程和力学，从多个互补视角整合信息。荧光显微镜已在分子尺度上成为连接显微术与光谱学的桥梁，并发展出受激发射损耗（STED）、单分子定位显微术（SMLM）等超分辨技术，在环境条件下达到纳米乃至埃（?ngstrom）级分辨率。然而，无标记成像方法，如穆勒矩阵（MM）偏振显微术，虽能提供丰富的结构信息，却缺乏分子特异性，无法直接识别特定生物分子。人工智能（AI）的引入为这一难题提供了解决方案：通过生成模型从无标记数据中预测类荧光分子对比，即“计算机标记”（in silico labelling）。该综述旨在介绍研究人员如何利用现代生成建模和智能多模态光学显微镜，将光学显微镜转变为能够探索纳米尺度生物分子景观的智能仪器。

研究人员提出并验证了一种两阶段处理流程：第一阶段使用Pix2PixHD（一种高分辨率条件生成对抗网络），将无标记图像转换为共聚焦荧光图像；第二阶段使用增强型超分辨率生成对抗网络（ESRGAN），将共聚焦图像逐步转换为单分子定位超分辨图像（如STORM或MINFLUX风格）。该流程的核心目标是实现从无标记到分子特异性图像的计算映射，并在保留生物可解释性的同时提升空间分辨率。实验样本包括HeLa细胞，其微管通过免疫染色标记；图像采集使用了Nikon A1 Eclipse共聚焦显微镜、Abberior MINFLUX显微镜、Nikon AX-NSPARC系统及自建的多模态MM-荧光显微系统。

在技术方法方面，研究人员综合运用了穆勒矩阵显微术获取无标记偏振信息，利用条件生成对抗网络（cGANs）进行图像域转换。Pix2PixHD通过结合像素级重建损失、特征匹配损失和基于VGG网络的感知损失，实现高分辨率图像生成；ESRGAN则通过感知损失和对抗训练学习超分辨率重建。定量评估采用峰值信噪比（PSNR）和结构相似性指数（SSIM）。此外，多模态MM-荧光显微系统能够同时获取无标记和荧光图像，为训练生成模型提供配对的图像数据。

研究结果按论文主体章节总结如下：

**1 引言**
研究人员指出多模态光学显微镜能够整合不同尺度和模态的信息，荧光与无标记偏振方法各有优劣。无标记技术虽缺乏分子特异性，但可以通过有监督映射生成分子图像。为此，他们提出了两阶段AI处理流程，为后续章节奠定框架。

**2 分子尺度的荧光光学显微术**
该章节综述了超分辨荧光显微术的两大类别：坐标靶向方法（如STED、RESOLFT）和坐标随机方法（如PALM、STORM、PAINT、MINFLUX）。通过MINFLUX成像实验，研究人员展示了纳米级单分子定位精度，并指出全细胞纳米级成像仍然耗时。因此，他们提出利用AI加速纳米尺度分析，并引入了ESRGAN作为超分辨生成工具。

**3 无标记穆勒矩阵光学显微术**
该章节阐述了穆勒矩阵显微术的原理，利用偏振光与物质相互作用产生无标记结构对比。其中，圆偏振强度差分散射（CIDS）可用于表征染色质等手性结构的压缩状态。研究人员展示了一种能够同时获取MM图像和荧光图像的多模态系统，为训练图像转换模型提供了相互配准的数据来源。

**4 多模态智能光学显微镜**
该章节详细描述了所提出的两阶段pipeline。第一阶段，利用Pix2PixHD将无标记图像转换为荧光图像，在1000对图像数据集上训练，测试集上的平均PSNR为24.4 dB，SSIM为0.82。第二阶段，利用ESRGAN将共聚焦荧光图像转换为超分辨图像，以逐步实现共聚焦到STORM再到MINFLUX的过渡。该策略能够在保留结构细节的同时逐步恢复分子尺度的信息。

**5 结论**
研究人员总结认为，该智能显微镜平台集成了荧光、无标记、偏振和力学敏感模态，能够实现增强的空间分辨率、定量准确性和时间效率。当前的主要局限性是缺乏同时包含无标记、共聚焦和超分辨图像的全链式配对数据集，未来工作将聚焦于采集此类多模态数据以进行端到端验证。此外，PSNR和SSIM虽然提供了图像质量的定量指标，但未直接评估生成结构的生物学有效性，后续需要引入基于任务或生物学意义的验证协议。

这项研究的重要意义在于，AI与光学显微镜的融合催生了“人工显微镜”的概念，其能够从生物样本中学习以增强对比度、减少光损伤，并揭示结构-功能之间的隐藏关联。该技术将推动生物光子学和纳米显微术的前沿发展，并重新定义科学发现中人类洞察力与机器智能的协作方式。论文发表在《Journal of Microscopy》。