N-花生四烯酰-磷脂酰乙醇胺磷脂酶D经毒蕈碱受体激活

《The Journal of Physiology》：N-Arachidonoyl-phosphatidylethanolamide phospholipase D activation by muscarinic receptors

　　

内源性大麻素信号系统由G蛋白偶联受体、信使分子——2-花生四烯酰甘油（2-AG）与阿南德酰胺（anandamide）——以及合成与代谢这些信使的酶促机器组成。阿南德酰胺具有生理重要性，但其合成机制尚未完全阐明。N-花生四烯酰-磷脂酰乙醇胺磷脂酶D（NAPE-PLD）可合成包括阿南德酰胺在内的酰基乙醇胺，但NAPE-PLD如何被激活仍不清楚。研究人员使用基于遗传编码G蛋白偶联受体的内源性大麻素（eCB）GRAB传感器及免疫组织化学展开探究。人胚肾293（HEK293）细胞天然表达Gq偶联的毒蕈碱M3受体。毒蕈碱激动剂氧化震颤素-M（oxotremorine-M）仅在HEK293细胞共转染NAPE-PLD时才能刺激GRABeCB传感器，该信号被NAPE-PLD抑制剂LEI401削弱，且同时依赖磷脂酶C与细胞内钙库。Gq偶联的mGluR5谷氨酸受体可有效替代M3受体。因此M3受体通过类似于2-AG合成的Gq信号通路刺激NAPE-PLD合成阿南德酰胺等酰基乙醇胺。副交感激活经肌上皮细胞上M3受体促进流泪与唾液分泌。大麻素信号系统可能作为反馈抑制因子抑制乙酰胆碱释放，但内源性大麻素信使的身份与来源不明。NAPE-PLD与M3蛋白在肌上皮细胞中共定位；脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）位于腺泡细胞。氧化震颤素-M刺激与HEK293-GRABeCB细胞共培养的泪腺或下颌下唾液腺可激发GRABeCB反应，该反应被LEI401减弱，且存在于表达阿南德酰胺特异性传感器GRABAEA的细胞中，而不存在于表达GRAB2AG的细胞中。研究人员得出结论：毒蕈碱M3受体在细胞系与外分泌腺中刺激NAPE-PLD产生阿南德酰胺。这种刺激阿南德酰胺合成的方式可能在体内发挥多种作用。

研究背景与立项依据

内源性大麻素信号系统依靠G蛋白偶联受体、双信使2-花生四烯酰甘油（2-AG）与阿南德酰胺（anandamide，AEA）及相应合成代谢酶发挥生理调控作用。相较2-AG合成通路（依赖二酰甘油脂肪酶DAGL受G_q偶联受体调控）研究较为清晰，阿南德酰胺的合成调控尤其是NAPE-PLD（N-花生四烯酰-磷脂酰乙醇胺磷脂酶D）的激活机制长期未明。既往提示细胞内钙升高参与阿南德酰胺生成，但缺乏在完整细胞与组织中实时监测的证据。HEK293细胞天然表达G_q偶联毒蕈碱M₃受体，外分泌腺（泪腺、唾液腺）中副交感M₃驱动分泌，而CB1激活抑制分泌，内源性反馈信使来源成疑。该研究旨在利用GRAB_eCB传感器明确M₃受体是否经G_q-PLC-钙库通路激活NAPE-PLD生成阿南德酰胺，并在外分泌腺中验证原生表达与功能意义。论文发表于《The Journal of Physiology》。

主要关键技术方法

研究采用HEK293细胞系（天然表达M₃）与小鼠/大鼠原代外分泌腺组织（雌鼠泪腺、雌雄小鼠下颌下腺、大鼠下颌下腺）双模型；使用遗传编码GRAB_eCB、GRAB_AEA、GRAB_2AG荧光传感器实时读值；通过共转染NAPE-PLD/mGluR5操控通路；药理学阻断PLC（edelfosine）、钙库（thapsigargin）、NAPE-PLD（LEI401）、FAAH（URB597）；离体腺片与传感器细胞共培养检测释放；免疫组化定位NAPE-PLD、M₃、FAAH、平滑肌肌动蛋白（SMA）。

研究结果

The muscarinic agonist oxo-M activates eCB sensor response in HEK293 cells expressing NAPE-PLD and GRAB_eCB

HEK293共表达NAPE-PLD与GRAB_eCB时，氧化震颤素-M（oxo-M）引发传感器响应，幅度约为2-AG最大响应的25%–35%；单转染传感器无响应；NAPE-PLD抑制剂LEI401（3 μM）几乎完全阻断该响应。结论：M₃受体激活引发的大麻素传感器信号依赖NAPE-PLD。

Muscarinic activation of NAPE-PLD requires PLC and full internal calcium stores

thapsigargin耗竭内质网钙库或过夜处理显著削弱oxo-M响应；PLC抑制剂edelfosine（20 μM）近完全取消响应。结论：M₃-G_q经PLCβ-IP₃-内钙释放是NAPE-PLD激活必要环节。

Anandamide-synthesizing and anandamide-metabolizing proteins are expressed in murine lacrimal glands

免疫组化显示泪腺腺泡细胞高表达FAAH（敲除对照阴性），肌上皮细胞（SMA阳性）共定位NAPE-PLD与M₃；下颌下腺小鼠/大鼠中NAPE-PLD同样定位于肌上皮细胞。结论：外分泌腺具备“M₃+NAPE-PLD”合成端与“腺泡FAAH”代谢端的解剖基础。

Muscarinic activation of acutely dissected lacrimal gland or SMG elicits an eCB sensor response

离体泪腺/下颌下腺切片与HEK293-GRAB_eCB共培养，oxo-M诱发传感器峰值约2分钟，LEI401预处理减弱该响应；FAAH抑制剂URB597不改变振幅。结论：原生外分泌腺经M₃刺激向胞外释放NAPE-PLD依赖性大麻素样分子。

eCB-specific sensors suggest muscarinic stimulation of lacrimal glands produces acylethanolamides

在加0.2% BSA的玻璃底皿体系中，泪腺刺激仅激活GRAB_AEA而非GRAB_2AG；OEA、PEA、LEA在10 μM不激活GRAB_eCB。结论：原生刺激产物以阿南德酰胺为主的酰基乙醇胺，非2-AG。

GPCR stimulation of NAPE-PLD is modular

HEK293共转mGluR5+NAPE-PLD+GRAB_eCB后，DHPG（50 μM）诱发响应，单转mGluR5无响应。结论：任意邻近G_q偶联GPCR（M₃、mGluR5）均可模块化激活NAPE-PLD。

讨论与结论浓缩

讨论指出，阿南德酰胺合成调控滞后于2-AG，NAPE-PLD敲除鼠后期研究方确立其核心地位；本研究在完整细胞与组织中实证M₃-G_q-PLC-钙库驱动NAPE-PLD生成阿南德酰胺，非神经元（肌上皮）亦可经内部钙库执行；外分泌腺中肌上皮产AEA→扩散至副交感末梢CB1→抑制乙酰胆碱释放，构成类似中枢2-AG反馈的外周负环，解释大麻致口干眼干；该通路具模块性，M₁/M₅/mGluR等均可能接入。结论部分原文意译：综上，实验证明阿南德酰胺合成可被G_q偶联GPCR在完整细胞与外分泌组织块中激活，该方式在非兴奋性细胞经内钙释放尤为相关；泪腺与下颌下腺采用此机制，G_q偶联GPCR刺激阿南德酰胺合成或广布全身。