《Journal of Phycology》：Crawling under the radar: Two novel Paulinella species expand knowledge about the ecology and evolution of a primary plastid-containing amoeba lineage
编辑推荐：
属Paulinella代表了罕见且独立发生的初级内共生案例，为研究细胞器演化的早期阶段提供了独特体系。本文通过发现并鉴定两株新型光合变形虫——Paulinella marae sp. nov.和Paulinella murrayi sp. nov.（分离自美国
属Paulinella代表了罕见且独立发生的初级内共生案例，为研究细胞器演化的早期阶段提供了独特体系。本文通过发现并鉴定两株新型光合变形虫——Paulinella marae sp. nov.和Paulinella murrayi sp. nov.（分离自美国北卡罗来纳州一处半咸水栖息地），拓展了当前对初级质体内共生的认识。完整的色鼠体基因组和线粒体数据揭示了保守的基因含量，但存在显著的结构变异，包括基因组重排和倒位事件。系统发育分析发现核基因组与细胞器数据集之间存在显著不一致，这可能由替代饱和、有限的分类群取样以及不同位点间不同的进化信号所致。多年生态学观察表明，这两个物种丰度较低但持续存在；结合业余爱好者的观测数据，支持光合Paulinella物种全球分布但采样不足的假说。这些结果将该支系内已知物种多样性从四种增加到六种，并凸显了将野外观察与基因组学方法相结合的重要性。总体而言，本研究推进了Paulinella作为研究进行中的初级内共生、谱系分化以及低丰度微生物真核生物生态策略的模式体系。
**论文解读：两种新型Paulinella物种的发现及其对初级内共生演化与生态学的启示**
**一、研究背景与科学问题**
初级内共生是极其罕见的事件，它导致了真核细胞的起源以及真核生物光合作用的后续演化。已知仅有两例初级质体起源案例：一例发生在超过15亿年前Archaeplastida祖先中，涉及捕获β-蓝细菌；另一例即为光合Paulinella支系，其通过涉及自由生活的α-蓝细菌细胞的初级内共生获得了光合作用能力，发生时间约为9000万至1.4亿年前。Paulinella中的光合细胞器被称为“色鼠体”，其基因组大小约为其他藻类和植物质体的六倍，且似乎仍在经历与宿主细胞生物学的进一步整合。这种相较于Archaeplastida而言的“不完全”状态为研究初级内共生和细胞器发生的根本过程提供了独特机会。然而，迄今仅描述了四种光合Paulinella物种，且仅有两个核基因组和三个物种的色鼠体基因组可用。此外，Paulinella物种难以在实验室培养中维持，倍增时间极慢（5-7天），细胞体积小且丰度极低，这些因素严重阻碍了对其细胞生物学、基因组学和自然历史的研究。因此，尽管Paulinella作为光合共生模式系统具有重要价值，但其生物学和生物多样性方面的许多关键问题仍未得到解答。
**二、研究内容与主要结论**
本研究描述了两个从美国北卡罗来纳州半咸水栖息地分离的新型光合Paulinella物种：Paulinella marae sp. nov.和Paulinella murrayi sp. nov.。研究人员报告了完整的色鼠体基因组、线粒体基因组、核分类标记基因以及基于5年自然样本观察的生态学见解。研究发现两个形态学上可区分且同域分布的物种，它们具有保守的基因含量但存在显著的结构变异，包括色鼠体基因组中的一次大倒位和线粒体基因组中的多次重排。系统发育分析揭示了核基因与细胞器系统发育之间的显著不一致，这被归因于替代饱和、有限的分类群取样和不同位点间不同进化信号的共同作用。多年生态观察表明两种物种均以低丰度持续存在，结合公民科学家的观测数据和全球海洋非靶向条形码检测，支持光合Paulinella物种全球分布但采样不足的假说。该研究将已知物种多样性从四种增加到六种，凸显了整合野外观察与基因组学方法的重要性，并推进了Paulinella作为研究进行中的初级内共生、谱系分化和低丰度微生物真核生物生态策略的模式体系。
**三、主要关键技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：
1. **单细胞分离与全基因组扩增**：从北卡罗来纳州Nag's Head的Roanoke Sound半咸水湿地（盐度10-14，pH约5.98）采集样本，利用拉制巴斯德移液管和微针等工具分离单个细胞，使用Qiagen REPLI-g Mini Kit进行全基因组扩增（WGA）。
2. **PacBio HiFi长读长测序与基因组组装**：四个WGA产物（Cell 2、5、6、9）在PacBio HiFi平台测序；色鼠体基因组使用TIPPo v1.3.0组装，通过read-mapping证据进行迭代延伸与合并，并最终确认环化。
3. **扫描电子显微镜（SEM）**：两种不同形态的细胞经0.22 μm过滤环境水和50%乙醇洗涤后直接滴加到SEM样品台上，镀金后在Phenom ProX台式扫描电镜下观察鳞片结构。
4. **系统发育分析**：构建18S rDNA、28S rDNA、色鼠体和线粒体基因数据集（分别含406和19个直系同源基因），使用IQ-TREE 2进行最大似然（ML）分析，用1000次超快自举（UFBoot）评估分支支持；使用PhyParts和自定义Python脚本量化基因树不一致性。
5. **替代饱和分析**：对rbcL基因进行密码子位置特异性（NT123、NT12、NT2）和氨基酸（AA）数据集分析，绘制饱和曲线评估替代饱和程度。
**四、研究结果**
**4.1 物种描述**
研究人员依据形态学和分子特征正式描述了Paulinella marae sp. nov.和Paulinella murrayi sp. nov.两个新物种。P. marae壳体长15.9-19.1 μm、宽11.8-15.9 μm，具有五列鳞片，每列9-10行，鳞片以左手方式（逆时针）重叠，具有5个口围鳞片；色鼠体基因组为970,001 bp，含861个CDS、6个rRNA和42个tRNA，GC含量36.5%。P. murrayi壳体长13.1-15.3 μm、宽11.1-12.8 μm，具有五列鳞片，每列8-9行，鳞片以右手方式（顺时针）重叠，缺乏其他物种中描述的两个主要口围鳞片；色鼠体基因组为980,939 bp，含866个CDS、6个rRNA和42个tRNA，GC含量37.5%。两种物种的8S rDNA基因序列相似性为98.47%-98.66%，28S rDNA序列相似性为96.87%，rbcL基因相似性为89.24%。
**4.2 Paulinella murrayi sp. nov.和P. marae sp. nov.的出现情况**
研究地点位于美国北卡罗来纳州Nag's Head的一个路边半咸水沼泽，盐度范围10-14，pH约5.98。自2021年起每年访问该地点1-2次，Paulinella细胞虽然稀少但每次都能观察到，6月初丰度较高。两种形态的细胞经常在同一移液管中观察到，表明两个物种分布重叠。经过数年的分离工作，研究人员在一周内获得了约22个细胞，其中4个成功用于WGA，2个用于SEM。长期无菌培养的尝试尚未成功。
**4.3 形态和行为显示两个不同的种群**
研究人员在2021年至2024年间于自然样本中观察到两种不同的形态型：P. marae型细胞较大、更光滑、更透明，每行鳞片更多且具有清晰的口围鳞片；P. murrayi型细胞较小、质地较粗糙、每行鳞片较少（可能缺乏口围鳞片），外观更不透明。SEM成像证实了两者在形态上的显著差异。值得注意的是，两种物种的鳞片重叠方向不同：P. murrayi为顺时针，P. marae为逆时针。这一特征是遗传的，且在物种内一致、物种间不同，因此被提出为潜在的新诊断特征。行为上，较大的细胞有时附着在基质上，利用丝足形成茎状“吸附”结构；较小的细胞通常自由漂浮。两种物种移动时丝足可延伸至壳体长度的四倍以上。
**4.4 分子数据支持两个不同Paulinella物种的认定**
18S rDNA基因1%的序列分歧通常被用作原生生物物种区分的粗略阈值。本研究中P. murrayi（Cell 5和6）与P. marae（Cell 9）的18S rDNA基因序列共享98.47%-98.66%的同一性，28S rDNA序列共享96.87%的同一性。与最近的物种描述P. acadia和P. longichromatophora之间的18S rDNA相似性（98.3%-99.2%）相比，尽管这两个北卡罗来纳物种同域分布，但它们之间的rDNA基因同一性差异甚至更大，再加上不同的形态特征、色鼠体基因组中的显著结构倒位、高度分歧的线粒体基因顺序以及分歧的rbcL基因序列，支持将它们认定为两个不同物种。
**4.5 细胞器基因组显示种间结构变异**
通过单细胞分离获得的四个细胞经WGA和PacBio HiFi测序后，研究人员获得了P. murrayi（Cell 5）和P. marae（Cell 9）的完整环状色鼠体基因组。P. murrayi的线粒体基因组为三个部分重叠群（partial contigs），P. marae则获得了单一完整的环状线粒体基因组（43,976 bp）。两个物种的色鼠体基因组大小分别为980,939 bp和970,001 bp，基因含量与其他光合Paulinella物种大致相似。在EGT候选基因方面，PCC 0564同源基因（推定的psaI同源基因）仅存在于P. chromatophora和P. longichromatophora中，而psaK基因则除P. chromatophora外均存在。结构分析显示，两种物种的色鼠体基因组之间存在一次大型倒位；线粒体基因组则存在大量重排。
**4.6 纳入两个新物种揭示了系统发育冲突**
在18S rDNA基因树中，P. murrayi和P. marae呈并系（paraphyletic）；而在基于406个色鼠体基因的串联系统发育树中，两者形成单系（monophyletic）分支，且P. micropora是光合Paulinella中最近分化的谱系。基于19个线粒体CDS的串联数据集构建的系统发育树与色鼠体系统发育在光合Paulinella支系上一致。28S rDNA基因树与两者均不一致且支持率低。PhyParts分析表明，在色鼠体系统发育中，光合Paulinella的单系性得到大多数基因的支持（一致的基因=340，冲突的=13），但某些内部支持率相对较高：P. micropora + P. longichromatophora + P. murrayi + P. marae支系获得290个基因支持，61个基因支持其他分裂。在单个基因树中，色鼠体基因树最常支持Type 1拓扑（n=234），这与串联色鼠体系统发育的拓扑一致。线粒体基因树中仅两个基因支持Type 1。
**4.7 rbcL基因表现出替代饱和**
rbcL基因分析显示，氨基酸树恢复为Type 4拓扑，而核苷酸树恢复为Type 2拓扑，两者不一致。基于密码子位置的系统发育分析表明，NT123（全部密码子位点）和NT12（第一和第二位点）产生的拓扑与氨基酸树不同，而NT2（仅第二位点）树与氨基酸拓扑一致。饱和分析显示，rbcL基因中推断的替代数超过观察到的替代数，在NT123中比氨基酸数据集更明显，其中第三密码子位点（NT3）的过量最显著。这些结果表明确实存在替代饱和，尤其影响第三密码子位点。
**五、讨论总结与研究结论**
在讨论部分，研究人员提出理解光合Paulinella内部的系统发育关系可能为经历初级内共生事件的祖先生态提供关键见解。但新物种的纳入揭示了系统发育不一致，可能由多种因素导致。第一，18S rDNA、28S rDNA和rbcL基因作为单基因不足以解析类群间的相互关系。第二，替代饱和可能影响了某些基因，特别是rbcL基因的第三密码子位点，从而误导系统发育推断。第三，当前的分类群取样可能不足以稳健地重建Paulinella内部的系统发育关系，需要更密集的分类群取样和更广泛的基因组与地理覆盖。
研究人员还讨论了低丰度但广泛分布的光合Paulinella的知识增长。两个物种在一个环境中被发现为研究光合Paulinella的生态角色、分布和种群遗传学提供了独特机会。P. murrayi和P. marae似乎是姐妹种，分布范围可能重叠于北卡罗来纳州Nag's Head地区。研究人员假设P. marae具有附生生活方式，其丝足在异养祖先中用于运动与摄食，现在被用于附着，使这种鳞片更光滑的物种固着在植物或硅藻鞘上，处于最佳光强位置。相比之下，P. murrayi的细胞更小、外观更粗壮，通常自由漂浮。
最后，研究人员讨论了内共生棘轮假说（ERH）作为Paulinella分化的驱动因素。该假说认为，初级内共生是不可逆、单向的谱系快速分歧和进化复杂性驱动因素。新形成的共生关系限制有效种群大小，增加生殖隔离和世代时间，通过增强遗传漂变和放松选择加速遗传分化。这些过程可以解释P. micropora和P. chromatophora之间10倍的基因组大小差异以及全球形态上有区别的小种群的分布。线粒体基因顺序的变化和色鼠体基因顺序的更高保守性为这一假说提供了证据，表明色鼠体仍处于基因组减少和EGT主要波次之间的间断平衡状态。
研究结论指出，通过鉴定和描述P. marae和P. murrayi，已知该支系的多样性从四种扩大到六种，并描述了一个易于访问且每次采样都能可靠观察到同域物种的野外站点。这两个物种可能在同域分化，由微栖息地适应驱动；或者它们在不同栖息地起源后因范围变化而相遇。目前还无法区分这两种情景，但北卡罗来纳站点为未来阐明光合Paulinella种群遗传学、物种相互作用和其他生态特征提供了理想场所，这些研究将推进对生活方式转变影响和初级内共生结果的理解。
