《Neuroscience Letters》：Early-passage human umbilical cord MSC–derived exosomes exhibit enhanced neurofunctional activity in neuronal cells
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摘要间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体是神经再生的有希望的介质，但其功能异质性尚未完全了解。我们研究了亲本细胞的传代次数和囊泡的完整性是否会影响从人脐带来源的MSC（hUC-MSC）中提取的外泌体的特性和生物学活性。通过棘球形形态和流式细胞术分析确认了hUC-MSC的身份，这些分
摘要
间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体是神经再生的有希望的介质，但其功能异质性尚未完全了解。我们研究了亲本细胞的传代次数和囊泡的完整性是否会影响从人脐带来源的MSC（hUC-MSC）中提取的外泌体的特性和生物学活性。通过棘球形形态和流式细胞术分析确认了hUC-MSC的身份，这些分析显示CD73、CD90和CD105的表达较高，而CD34和CD45的表达较低。从第1代（P1）、第3代（P3）和第5代（P5）培养物中分离的外泌体通过纳米粒子追踪分析（NTA）、荧光NTA、扫描电子显微镜和Western blotting进行了表征。在Neuro-2a（N2A）细胞中，通过βIII-微管蛋白、MAP2和NeuN的免疫荧光分析以及CCK-8检测评估了它们的生物学效应。P1代衍生的外泌体与神经元相关标记物的表达增加、类神经突形态以及CCK-8代谢活性增强有关，而经过热处理的外泌体的生物学活性减弱。这些发现表明，亲本细胞的传代次数和囊泡的完整性会影响hUC-MSC衍生外泌体的生物学活性，并强调了标准化MSC表征、传代控制和外泌体质量评估对于开发可重复的神经再生产品的重要性。
引言
外泌体是纳米级的细胞外囊泡（30–150纳米），通过转移蛋白质、脂质和核酸来介导细胞间通讯。越来越多的证据表明，外泌体在神经稳态和组织修复中起着关键作用，并已成为神经系统疾病无细胞疗法的有希望的候选物[1]、[2]、[3]。与基于细胞的方法相比，基于外泌体的策略在安全性、降低免疫原性和可扩展性方面具有优势。
间充质干细胞（MSC）是治疗性外泌体的主要来源，因为它们易于获取且具有强大的旁分泌活性。MSC衍生的外泌体通过传递微RNA和信号蛋白等生物活性物质，再现了关键的神经营养效应，包括促进神经元存活、神经突生长和突触可塑性[3]、[4]。在MSC来源中，人脐带来源的MSC（hUC-MSC）因其非侵入性来源和高增殖能力而特别引人注目。据报道，hUC-MSC衍生的外泌体可以促进神经元相关反应，增强神经突生长，并在实验模型中发挥神经保护作用[5]。除了其神经营养特性外，hUC-MSC衍生的外泌体还被报道可以调节肿瘤细胞的行为，突显了它们依赖于环境的生物学功能[6]。
对于临床应用而言，外泌体的质量和功能性受培养条件和细胞状态的影响。人血小板裂解液（hPL）已成为无异源蛋白的替代品，可以在保持MSC功能特性的同时支持其快速扩增[7]、[8]、[9]。外泌体的生物学活性高度依赖于囊泡的完整性，并且容易受到物理化学应激的影响，包括高温、反复冻融循环和极端pH值，即使颗粒大小基本保持不变，这些因素也可能损害其生物学功能[8]、[10]、[11]、[12]、[13]。
重要的是，亲本MSC的传代次数是影响外泌体功能的一个关键但未充分研究的因素。连续传代会导致细胞衰老并改变分泌谱型，这可能会影响外泌体的生成和 cargo 组成[3]、[6]、[14]。尽管先前的研究表明早期传代MSC衍生的外泌体显示出更强的再生潜力[15]，但在无异源蛋白培养条件下，对hUC-MSC衍生外泌体的传代依赖性变化的系统评估仍然有限。
在这项研究中，我们探讨了亲本细胞的传代次数和囊泡的完整性如何影响hUC-MSC衍生外泌体的特性和生物学活性。从第1代（P1）、第3代（P3）和第5代（P5）培养物中提取的外泌体通过纳米粒子追踪分析、荧光纳米粒子追踪分析、扫描电子显微镜和Western blotting进行了定量表征。通过CCK-8代谢检测和神经突样形态及神经元相关标记物表达的免疫荧光分析来评估它们对N2A细胞的生物学效应。为了表征亲本hUC-MSC，仅使用Nestin和F-actin免疫染色来描述细胞形态和细胞骨架组织，而不是为了证明神经分化或替代标准的MSC免疫表型鉴定。
章节片段
细胞培养
hUC-MSC是在台中路军人总医院（IRB编号CF24551A）批准的方案下，经书面知情同意获得的。细胞在添加了2% hPL（EliteGro?，Tengda，台湾）和1%青霉素-链霉素（Gibco，美国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，美国）中培养。培养条件为37°C，含有5% CO2的湿润环境，并在80–90%的融合度时进行传代。外泌体是从细胞中收集的
hUC-MSC的表征
人脐带来源的间充质干细胞（hUC-MSC）显示了典型的棘球形成纤维细胞样形态，这是培养MSC所预期的（图1A-B）。免疫荧光染色显示细胞质中外泌体相关蛋白TSG101以及F-actin和Nestin的表达，这些用于表征细胞内蛋白质分布、细胞骨架组织和细胞形态，而非神经分化（图1C-D）。流式细胞术分析
讨论
hUC-MSC因其易获取性、高增殖能力和良好的安全性而成为治疗性细胞外囊泡的有吸引力的来源。在本研究中，hUC-MSC在使用hPL的无异源蛋白培养条件下成功扩增。流式细胞术分析确认了MSC的典型免疫表型，其特征是高度表达经典的MSC标记物CD73、CD90和CD105，而造血标记物CD34的表达较低
意义陈述
本研究显示了人脐带间充质干细胞衍生外泌体的传代相关性异质性，并表明完整的P1代衍生外泌体与N2A细胞中增强的神经元相关反应有关。这些发现强调了亲本细胞的传代次数、囊泡的完整性以及标准化的外泌体质量评估对于可重复开发基于外泌体的神经再生应用的重要性。
伦理批准和参与同意
数据和材料的可用性
支持本研究结果的数据可向相应作者提出合理请求后获得。相关原始数据和补充数据也在本文的补充材料中提供。
CRediT作者贡献声明
Tun-Juh Chong：撰写 – 原始草稿，数据管理，概念化。Meng-Yin Yang：方法学，资金获取，正式分析。Li-Ling Lin：资源，方法学。Ping-Ting Hung：资源，方法学。Hsueh-Wen Hu：方法学。Bai-Shuan Liu：。Hsin Chih-Yu：。Chou Jiou-Fei：。Chun-Ming Yen：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学。Yi-Chin Yang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，数据管理，概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了台中路军人总医院（TCVGH-CTUST1137703和TCVGH-1134901B）、台湾青年神经外科医师教育基金会和台湾中青年神经外科教育基金会（TMYNSF）的支持。作者感谢XiangYu动物生物医学医院提供ZetaView纳米粒子追踪分析仪的使用。
Tun-Juh Chong|Meng-Yin Yang|Li-Ling Lin|Ping-Ting Hung|Hsueh-Wen Hu|Bai-Shuan Liu|Hsin Chih-Yu|Chou Jiou-Fei|Chun-Ming Yen|Yi-Chin Yang
