《Next Nanotechnology》：Albumin-based cationic nanoemulsion for Protoporphyrin IX delivery in normoxic and hypoxic conditions
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胶质母细胞瘤是人类最致命的癌症之一，但其治疗受到药物难以穿越血脑屏障的限制。基于白蛋白的纳米材料已成为神经肿瘤学应用中颇具前景的药物递送系统，尤其是用于高级别胶质瘤的治疗。本研究展示了一种负载原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PpIX）的人血清白
胶质母细胞瘤是人类最致命的癌症之一，但其治疗受到药物难以穿越血脑屏障的限制。基于白蛋白的纳米材料已成为神经肿瘤学应用中颇具前景的药物递送系统，尤其是用于高级别胶质瘤的治疗。本研究展示了一种负载原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PpIX）的人血清白蛋白纳米乳（human serum albumin nanoemulsion，HSANE）作为高级别胶质瘤纳米载体的开发与评估。HSANE采用水包油自发乳化法制备。粒径在200–300 nm之间的纳米颗粒表现出优异的理化性质以及负载PpIX的能力，所得纳米乳的高荧光信号证实了这一点。研究人员在常氧和低氧条件下，对三种高级别胶质瘤细胞系（A-172、U-87 MG和KNS-42）评估了负载PpIX的HSANE的摄取效率和细胞毒性。孵育6小时后，在所有测试的细胞系中均发现PpIX分布于细胞核及核周区域，表明其具有强发射信号，支持其作为诊断标记物载体的潜力。在低氧条件下，HSANE表现出更高的细胞核内化水平。对于所有胶质瘤细胞系，均未观察到细胞毒性。这些结果表明，纳米制剂HSANE作为一种有前景的药物载体和肿瘤标志物递送系统，未来可应用于高级别胶质瘤的治疗与诊断，其高荧光信号可用于高级别胶质瘤的检测、定位和诊断。
胶质母细胞瘤治疗与诊断的纳米策略：人血清白蛋白纳米乳递送原卟啉IX的研究解读
**一、研究背景与现存问题**
胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是人类最致命的癌症之一，属于IDH-1/IDH-2野生型的高级别弥漫性胶质瘤，占所有胶质肿瘤的60%–70%，占所有颅内肿瘤的15%。在美国，65岁以上老年患者中GBM的发病率约为13.16/10万。GBM患者的中位生存期仅为术后与治疗后的15–18个月，仅有0.71%的患者在确诊后存活十年以上。
GBM治疗耐药和预后不良主要源于以下因素：第一，单个肿瘤细胞可浸润至距肿瘤核心数厘米以外的区域，沿白质纤维束和血管周围间隙播散，累及远处脑实质和深部灰质结构，且这些区域往往存在完整的血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）。第二，GBM细胞对标准化疗药物具有高度耐药性，加上BBB对药物通透性的限制，使得药物在肿瘤周边的浓度极为有限。以常用的烷化剂替莫唑胺为例，其在血浆中枢神经系统中的浓度仅为血浆浓度的30%–40%。第三，高度肿瘤细胞异质性和基因组不稳定性导致不同遗传和表观遗传学改变的细胞克隆产生，赋予肿瘤对常规疗法不同程度的抵抗。第四，缺氧肿瘤微环境触发缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）的过表达，该转录因子家族在肿瘤细胞适应低氧张力中发挥关键作用，并激活与细胞增殖、迁移、代谢、肿瘤血管生成、干细胞特性和治疗耐药相关的多个关键基因。
当前，仅有少数临床试验探索纳米颗粒用于GBM治疗。GBM模型从临床前研究转化至临床试验的成功率不足8%。迄今为止，尚未有纳米颗粒被报道可同时实现GBM治疗和通过成像辅助诊断或手术切除，从而改善肿瘤定位。根据clinicaltrials.gov的最新检索，仅有两项研究在积极招募纳米颗粒干预的参与者，均与铁纳米颗粒相关，且很少有试验进展超过I期。因此，规避BBB的选择性渗透以更好地递送化疗药物和/或靶向HIF-1通路的生物药物，可能实现更大的治疗效果，具有极其重要的意义。
近年来，脂质、聚合物和蛋白质颗粒，特别是白蛋白颗粒，已被证明能够穿越生物膜并将活性药物携带进入活细胞而不破坏膜完整性。既往研究表明，蛋白质药物递送系统与光活性化合物（如酞菁氯化铝）联用，结合可见光照射，可在肿瘤细胞中引起致死性光损伤，可能是治疗恶性胶质瘤的有效工具。商业化药物Abraxane?（白蛋白纳米颗粒负载紫杉醇）已被批准用于癌症治疗，特别是胰腺癌和乳腺癌，凸显了其靶向药物递送的潜力。鉴于肿瘤细胞会从肿瘤表观边界迁移，且缺乏能通过荧光原位检测肿瘤细胞并评估肿瘤范围的技术，研究人员开展本研究，旨在开发一种可高效递送药物以治疗弥漫性胶质瘤的原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PpIX）白蛋白纳米乳。该研究描述了一种治疗诊断学策略，使用负载PpIX的人白蛋白纳米乳，产生明确的荧光信号，可在联合抗体、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或光（光动力疗法，photodynamic therapy，PDT）时帮助检测、定位、诊断并潜在治疗高级别胶质瘤。
**二、主要技术方法**
研究人员采用水包油自发乳化法制备人血清白蛋白纳米乳（human serum albumin nanoemulsion，HSANE）。通过光子相关光谱（photon correlation spectroscopy，PCS）测定纳米乳的平均流体动力学直径和多分散指数（polydispersity index，PDI），利用可调谐电阻脉冲传感（Tunable Resistive Pulse Sensing）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）表征纳米颗粒的粒径分布与形貌。采用紫外-可见吸收光谱和稳态/时间分辨荧光光谱评估PpIX的光物理性质，包括摩尔吸收系数、荧光量子产率和荧光寿命。共聚焦激光扫描显微镜用于观察细胞内摄取和亚细胞定位，并通过Fiji/ImageJ软件的Coloc2插件进行共定位定量分析。MTT比色法用于评估细胞活力，流式细胞术用于细胞周期分析。细胞实验使用三种胶质瘤细胞系：A-172（ATCC? CRL-1620?）、U-87 MG（ATCC? HTB-14?）和KNS-42（里约热内卢细胞库），分别在常氧（pO
2 = 20.9%）和低氧（pO
2 = 1.0%）条件下进行。
**三、研究结果**
**3.1 白蛋白纳米乳的制备与表征**
研究人员选择乳液基质的组成以获得计算亲水亲油平衡值（hydrophilic-lipophilic balance，HLB）为17的配方，该值对应强亲水体系，有利于水包油分散稳定性。HSANE流体动力学尺寸在180天内保持稳定，表明其在水中的稳定性良好，ζ电位呈阳性，归因于DOTAP（dioleoyl-3-trimethylammonium propane）的存在。可调谐电阻脉冲传感和TEM分析确认了负载PpIX的HSANE纳米结构直径在180–400 nm之间，其中75%的颗粒直径在180–250 nm之间。负载PpIX的HSANE在所用合成条件下呈现均匀球形形态，分散性低（±20 nm）。
光谱表征方面，游离PpIX在DMSO中呈现404 nm处的Soret带和503、539、572、627 nm处的四个Q带，为PpIX单体的典型特征。荧光光谱显示约632 nm处的发射带，同样为其单体态特征。负载于HSANE中的PpIX在406 nm处吸收系数为66,000 L·mol
?1·cm
?1，低于游离态值，表明HSANE内部分PpIX发生自聚集。这种自聚集可防止靶细胞外负载PpIX的HSANE产生高荧光信号——细胞摄取后荧光团倾向于在细胞内解聚，增强单体荧光信号，有利于光诊断应用。最佳激发波长位于391–417 nm之间，最佳荧光信号在630–639 nm之间。HSANE中PpIX的荧光量子产率为0.12 ± 0.01，高于有机溶剂中的值，对光诊断应用至关重要。时间分辨荧光显示长寿命约8.7 ns和短寿命约2.0 ns。PpIX在HSANE中的包封效率为71.25% ± 5.3%，这可能与PpIX水溶性低导致药物被包埋于纳米颗粒油核中有关。
**3.2 纳米颗粒的体外细胞摄取**
研究人员使用三种商业细胞系在常氧和低氧条件（pO
2 1.0%）下进行细胞培养实验，每组三次重复。细胞培养图像显示低氧条件下细胞呈现间充质样表型共享。
共聚焦显微镜和共定位分析确定了HSANE-PpIX在细胞内的亚定位。在所有测试细胞系中，PpIX均定位于核和核周区域，表明其发射信号强，有利于作为诊断标记物的载体。在低氧条件下，该制剂表现出更高的细胞核内化程度，细胞内颗粒发射的荧光信号增强，可能在体内实体瘤和胶质瘤中实现更好的定位。
通过多种相关分析方法对共聚焦图像进行量化验证。共定位分析揭示了不同胶质母细胞瘤细胞系常氧和低氧条件下纳米颗粒与细胞核通道关联的不同特征。6小时为最佳内化时间，所有后续实验均采用此时间点。
研究发现，负载于HSANE上的PpIX比DMSO分散的游离PpIX（作为细胞渗透剂）在相同颗粒浓度下具有更高的荧光发射。这一发现强有力地证明HSANE提高了PpIX在以水为主的细胞环境中的生物利用度和细胞摄取，克服了载体辅助递送的局限性，与既往报道一致。常氧条件下各细胞系摄取率不同，其中A-172摄取最高。低氧条件下所有细胞摄取率几乎相同，但A-172仍显示高出两倍的摄取，这归因于其高代谢率，这也证实了实体瘤需要采用低氧条件进行研究。这与Yang等人的观察一致，即含白蛋白纳米颗粒在深部胶质母细胞瘤和缺氧环境中的积累可能得到促进，因为白蛋白结合蛋白介导的转运可能发生，促进摄取、穿越血脑屏障并增加到达肿瘤细胞的能力。此外，白蛋白纳米颗粒可通过特定机制（被动或主动）轻松穿透BBB，如SPARC和gp60介导的仿生转运。
**3.3 细胞毒性与细胞周期分析**
通过MTT实验评估了HSANE和PpIX负载制剂的细胞毒性，以确定胶质瘤细胞的无毒浓度阈值。与对照组相比，空纳米载体和包封的PpIX均未表现出暗毒性。这些发现与既往研究一致，表明白蛋白纳米颗粒作为癌症治疗中的安全和仿生平台。
为进一步确定治疗窗口，研究人员还评估了630 nm光照射的效果。在所研究的浓度和不同光剂量下均未观察到光毒性效应。这些数据表明，细胞内PpIX浓度低于产生细胞毒性活性氧（reactive oxygen species，ROS）所需的阈值，同时超过荧光成像的检测限。这种双重特性支持将该制剂开发为非破坏性诊断纳米工具。
流式细胞术用于评估细胞周期改变，基于碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后细胞DNA含量的单变量分析及DNA含量频率直方图的去卷积。A-172即使在PpIX高浓度下也与制剂具有更高的相容性。对于U-87 MG和KNS-42细胞系，浓度高达1.0 μmol·L
?1的处理未显示统计学差异，表明应用是安全的。细胞系分类可能解释基于基因表达的细胞活力差异。间充质亚型U-87 MG和KNS-42对TNFRSF1A和MGMT基因的抵抗力较低。相反，A-172被分类为前神经亚型，与三羧酸循环相关基因（如IDH-1）的突变相关，该突变导致功能获得性酶活，产生异常的促癌代谢产物2-HG，可能促进肿瘤发生和广泛的超甲基化表型。该亚型还与血小板衍生生长因子受体α的扩增相关，该受体对脑发育至关重要，但与INK4A/ARF缺失相关时其过表达与胶质瘤发生相关。
**四、讨论与结论**
尽管GBM的诊断和治疗取得了进展，但作为高度侵袭性肿瘤，仍存在显著差距。当前临床试验中技术转化的可行选择有限，凸显了对改进设计、质量控制和方案标准化的持续需求。因此，纳米颗粒的开发需要高度结构化和严格的方法。所开发的纳米制剂目前处于TRL 4级评估阶段，作为GBM的双重诊断和治疗制剂具有前景，在光疗方面具有特异性疗效。
本研究合成并表征了一种高稳定性杂化白蛋白纳米乳HSANE，其阳离子特性与PpIX相容。在体外剂量高达3.0 × 10
?6 mol·L
?1时未观察到毒性。在所有评估的细胞系中，HSANE定位于细胞核和核周区域并产生强信号，凸显其作为诊断标记物载体的可行性。剂量高达3.0 × 10
?6 mol·L
?1时未观察到细胞毒性和光毒性。所有观察结果表明，HSANE是一种有前景的药物载体递送系统，可用于光诊断和胶质母细胞瘤治疗。从临床转化的角度来看，小尺寸、高荧光、选择性摄取和低毒性是极为有利的特性。利用这种类型的纳米颗粒，可以穿过BBB，在PDT方法中产生ROS，并降低噪声比，这对术中切缘界定很重要。未来工作应在药物释放、遗传毒性和剂量-反应效应方面对该制剂进行更深入的研究。
