《New Biotechnology》：Bioengineering and physicochemical optimization of ergothioneine production by
Aspergillus oryzae
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研究人员通过对米曲霉（Aspergillus oryzae）中麦角硫因（Ergothioneine，EGT）合成酶的亚细胞定位分析，构建了高产EGT的工程菌株。研究表明，AoEgtB的N端内含无序区（Intrinsically Disordered Regio
研究人员通过对米曲霉（Aspergillus oryzae）中麦角硫因（Ergothioneine，EGT）合成酶的亚细胞定位分析，构建了高产EGT的工程菌株。研究表明，AoEgtB的N端内含无序区（Intrinsically Disordered Region，IDR）会导致蛋白聚集，进而抑制EGT合成；因此过表达AoEgtA与AoEgtC的EgtACO菌株在Czapek酵母蛋白胨（CZYP）培养基中表现最优。物理化学优化显示，在CZYP培养基中添加L-蛋氨酸（L-methionine）100 mg/L及硫酸锌（ZnSO?）1.5 g/L、静态培养、蓝光（480 nm）照射并结合第2、3天重复接种分生孢子，可使EGT滴度达1895 mg/L。与产细菌素（bacteriocin）乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）共培养可抑制污染且不影响米曲霉生长。以农业废弃物（马铃薯皮、甘薯皮）为基质静态发酵，EGT滴度达308 mg/L。该研究为EGT的微生物高效制造提供了菌株改造与工艺优化双重策略。
研究背景与立项依据
麦角硫因（Ergothioneine，EGT）是一种组氨酸衍生的含硫氨基酸，因强抗氧化及抗衰老活性于2017年获GRAS认证，广泛应用于化妆品、食品防腐及神经保护治疗。动物与植物不能自身合成EGT，传统生产依赖大型真菌子实体，但周期长、难以规模化。丝状真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）具有安全、易遗传操作的优势，其基因组含内源同源基因AoEgtA、AoEgtB、AoEgtC，但野生型产量低。已有研究将粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）NcEgt-1/2转入米曲霉仅获231 mg/kg固体基质产量。因此，研究人员从酶亚细胞定位出发改造菌株，并系统优化理化参数，以实现EGT的高水平微生物制造。本文发表于《New Biotechnology》。
主要技术方法概述
研究人员以米曲霉RIB40野生型基因组为模板，利用Inverse PCR与In-Fusion克隆构建单/双/三基因过表达载体（含Aotef1启动子、AosC/niaD/ptrA筛选标记），转化NSlDN1/NSlDS1/NSlD1宿主获得系列工程株；通过EGFP/mCherry融合荧光显微镜判定AoEgtA/B/C亚细胞定位，结合AlphaFold、InterPro、IUPred3预测AoEgtB三维结构与无序区；采用HPLC（HILIC柱，254 nm）定量菌丝内EGT；以DPY与CZYP液体培养基比较产率，系统考察黑暗/蓝光（480 nm，400 μmol·m?2·s?1）、静/摇床、培养时长、L-组氨酸/L-蛋氨酸/L-半胱氨酸添加、ZnSO?梯度、与植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）JCM 1149、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JCM 5885、产nisin Z乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）JCM 7638共培养、重复接种及马铃薯皮/甘薯皮废弃物培养基等条件。
研究结果
3.1 米曲霉EGT合成酶的亚细胞定位分析
研究人员将EGFP融合至AoEgtA/B/C的N端或C端，荧光显微镜显示AoEgtA与AoEgtC定位于细胞质，AoEgtB-N-EGFP呈胞质分布而C端融合则聚集。换用单体mCherry仍聚集，时序成像呈相分离点状融合-分裂动态。AlphaFold与IUPred3预测AoEgtB N端1-113残基为无序区（Intrinsically Disordered Region，IDR）；删除此IDR后定位均一化，仅IDR-mCherry即成聚集体，证明IDR是相分离聚集的必要充分结构。
3.2 菌株筛选与培养基评价
在DPY与CZYP中测试12株工程菌，EgtACO（过表达AoEgtA+AoEgtC）产量最高，DPY中476.5 mg/L、CZYP中699 mg/L；三基因EgtABCO因AoEgtB过表达致IDR聚集反而低于EgtACO。延长培养至7-11天产量下降、生物量降低，5天为最佳收获期。
3.3 与乳酸菌共培养对EGT生产的影响
EgtACO在DPY中与三种乳酸菌分别或混合共培养，黑暗下EGT略降（如单接植物乳杆菌387.5 mg/L vs 对照475 mg/L），蓝光下对照达670 mg/L而共培养组降低，表明竞争抑制无正向诱导。产nisin Z乳酸乳球菌JCM 7638在DPY中细菌素活性低于MRS对照，但其nisin Z不抑制米曲霉生长，提示该共培养体系可借细菌素控污而不伤主菌。
3.4 培养基成分优化
在CZYP中添加100 mg/L L-蛋氨酸使EGT升至1468.5 mg/L，三氨基酸混合为908 mg/L，单独L-蛋氨酸更优因其直接供给S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）甲基供体。ZnSO?在CZYP中1.5 g/L时达峰1565 mg/L，DPY中任何浓度均抑制EGT（生物量反增），归因子CZYP含NaNO?与KCl维持金属/渗透稳态。
3.5 培养条件优化
静态培养优于摇床（CZYP静态黑暗1369 mg/L vs 摇床699 mg/L）；蓝光下摇床优于静态。重复接种（第2、3天补分生孢子）+蓝光+CZYP+摇床150 rpm使EgtACO产EGT达1895±2.5 mg/L，为全文最高值。
3.6 农业废弃物经济生产
以4%马铃薯皮或甘薯皮替代碳源静态培养5天，EGT分别为293与308.5 mg/L，高于DPY对照，证明果皮中缓释碳水/蛋白促次级代谢分配。
讨论与结论翻译
讨论指出，AoEgtB的IDR介导相分离聚集是过表达该基因反效的结构基础，故双基因（A+C）组合优于三基因；乳酸菌共培养虽未增产，但nisin Z产生菌可提供无污染培养屏障，系首次报道；重复接种与蓝光协同打破单次接种的光/营养限制，使米曲霉EGT滴度跨入克/升级。农业废弃物平台兼顾成本与产率。
结论部分原文浓缩翻译：受EGT多领域应用驱动，研究人员以具生物工程潜力的米曲霉为宿主，证实AoEgtB因含IDR其过表达损害产量；与产细菌素乳酸菌共培养可降低长期培养污染风险；本研究首次提出乳酸菌共培养与重复接种联用优化EGT生产。所获EgtACO菌株配合CZYP、L-蛋氨酸、ZnSO? 1.5 g/L、蓝光、静态-摇床重复接种工艺达1895 mg/L，农业废弃物体系达308 mg/L，为EGT微生物制造提供可放大策略。
