裂解性噬菌体鸡尾酒弱化耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌—鲍曼不动杆菌混合物种生物膜并重塑转录响应

《Microbial Biotechnology》：A Lytic Bacteriophage Cocktail Attenuates Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae–Acinetobacter baumannii Mixed-Species Biofilms and Reshapes Transcriptional Responses

　　

由耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）与耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）形成的混合物种生物膜可使器械相关感染临床管理复杂化；然而针对此类群落的噬菌体干预策略仍缺乏充分表征。研究人员评估了裂解性HZJ31+HZY2308噬菌体鸡尾酒对KPZ2–AB48混合物种生物膜的抗菌膜活性。与相应单物种培养物相比，共培养物显示出更高的结晶紫染色生物量、以2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯)-2H-四唑-5-甲酰苯胺（XTT）还原法测得的代谢活性及显微表面覆盖率。在生物膜发育期间或生物膜形成后暴露于噬菌体鸡尾酒，降低了生物量、XTT还原值、可培养细菌计数及扫描电镜（SEM）衍生的表面覆盖率，在中央静脉导管表面亦观察到类似变化。在Galleria mellonella感染模型中，鸡尾酒处理提高了存活率，并与较轻微的组织病理学损伤及较低的克氏针相关细菌负荷相关。RNA测序（RNA-seq）与定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）识别出涉及代谢通路、自诱导物-2（AI-2）转运、细胞包膜功能、外排系统及应激响应的处理相关转录变化。这些发现支持针对多重耐药混合物种生物膜开展噬菌体鸡尾酒的进一步临床前研究。

研究背景与立项依据

耐碳青霉烯革兰阴性菌因治疗选择有限且传播与不良结局风险高而被WHO列为危急优先级病原体，其中CRKP与CRAB常定植于导管、关节及内固定等医疗器械表面并形成生物膜。生物膜内基质屏障、代谢低下、持留菌及应激响应使其对常规抗菌药耐受，而临床感染多为多物种群落，CRKP与CRAB共存可通过共聚集、营养互作、群体感应交叉保护增强耐受性，但针对CRKP–CRAB混合物种生物膜及器件表面噬菌体干预的系统评价尚缺。鉴于单噬菌体存在宿主谱窄与耐药涌现限制，研究人员构建临床分离株KPZ2–AB48与KP703–AB48混合生物膜体系，组合靶向KP的HZJ31（或HZJ33）与靶向AB的HZY2308成鸡尾酒，跨体外、中央静脉导管（CVC）表面及Galleria mellonella体内模型评价抗生物膜表型，并以RNA-seq与qRT-PCR解析残留菌群转录重塑，论文发表于《Microbial Biotechnology》。

主要关键技术方法

研究人员采用河南中医院临床实验室分离的CRKP（KPZ2、KP703）与CRAB（AB48）株，以MALDI Biotyper鉴定、VITEK 2判敏；将裂解性Caudoviricetes噬菌体HZJ31（Autotranscriptaviridae科Przondovirus属）、HZY2308（Hirszfeldviridae科Burnvirus属）按预设感染复数（MOI）配成1:1鸡尾酒。表型端用结晶紫定量生物量、XTT测代谢还原、荧光显微镜与SEM（经Trainable Weka Segmentation量化表面覆盖率）、平板计数活菌；器件端建CVC段与不锈钢克氏针（K-wire）生物膜；体内端用G. mellonella幼虫混合感染及K-wire植入异物模型评生存、组织学（H&E半定量0–9分）与器械菌载；分子端对处理1 h混合培养做rRNA去除链特异性RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000，DESeq2筛|log₂FC|≥2且p≤0.05），选14基因以qRT-PCR（2^?ΔΔCt法）验证。

研究结果

3.1 噬菌体鸡尾酒筛选与体外活性：在浮游单种与混合培养中，HZJ31+HZY2308使OD₆₀₀持续低于对照，残余内毒素约470.2 EU/L（低于250 EU/10⁷ PFU限值），选其作后续KPZ2–AB48主线组合。

3.2 单种与混合生物膜特征：KPZ2–AB48共培养24 h结晶紫OD₅₉₅≈1.46、XTT OD₄₉₀≈1.498，均高于单种；SEM显示共培养48 h表面覆盖率62.60%，显著高于KPZ2（16.55%）与AB48（26.68%），证实混合物种具更强聚集与基质样物质。

3.3 鸡尾酒对混合生物膜作用：接种同期加入使24–72 h结晶紫降0.641–0.476、XTT抑制78.07%–65.84%；预处理成熟膜6 h后活菌膜相关KP与AB分别降约1.4与1.5 log₁₀ CFU/mL；SEM覆盖率从73.64%降至约9.4%。

3.4 CVC表面覆盖：未处理CVC表面菌覆盖38.83%，形成期与成熟膜处理后分别降至2.44%与4.51%。

3.5 G. mellonella体内效应：1×10⁷ CFU/mL混合感染下，MOI 1000鸡尾酒96 h存活83.33%（单噬菌组≤33.33%，感染对照25%）；K-wire植入模型即时与延迟24 h给药MOI 1000存活66.67%与58.33%，器械上KP/AB菌载显著降低，组织损伤评分低于对照。

3.6 转录组响应：KPZ2中2570差异基因（323上/2247下），下调富集三羧酸循环、氧化磷酸化、碳代谢，上调富集核糖体、分泌系统；AB48中270差异基因（159上/111下），上调富集生物膜形成、脂肪酸合成，下调富集蛋白导出、β-内酰胺耐药。qRT-PCR印证KPZ2的lsrB/lsrC（AI-2转运）、cycB/frdD下调、marA/arnB上调，AB48的acrB/mexB_1/ampC上调、envZ/gacA下调。

讨论与结论翻译

研究人员讨论指出，CRKP–CRAB共培养呈现超越单种叠加的生物膜表型，HZJ31+HZY2308因双宿主互补在浮游、微孔板、CVC、K-wire及幼虫体内均弱化膜负荷；发育期给药优于成熟膜后处理，归因于基质屏障与代谢异质性；转录层面两菌呈物种特异响应——KPZ2偏代谢下行与AI-2转运抑制、AB48偏外排与包膜重塑，构成残留菌候选通路而非单因果机制；局限含仅代表性株对、单时间点转录、无哺乳类免疫/药动模拟及未系统评噬菌体耐药与联用。结论部分译文：综上，HZJ31+HZY2308鸡尾酒在体外、医疗器械及无脊椎动物感染模型中降低了CRKP–CRAB混合物种生物膜的多项负荷指标，支持进一步评价同时靶向两菌的噬菌体鸡尾酒策略以应对多重耐药多微生物生物膜；两菌处理相关转录变化进一步识别出可供机制验证的候选生物学通路。