《Molecular Plant Pathology》：The ER–Golgi Lipid Exchanger PsORP1 Is Essential for Phytophthora sojae Development and Is Blocked by Oxathiapiprolin via Its OSBP-Related Domain (ORD)
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氧甾醇结合蛋白（OSBP）相关蛋白（ORPs）是真核生物不可或缺的脂质转运体，也是药物和农用化学品开发的极具前景的靶标。在跨越生物界的ORP家族成员中，卵菌ORP1构成一个系统发育上独特的亚型，它在卵菌中独立进化，与动物、植物和真菌中的ORP同源物显著不同。氟
氧甾醇结合蛋白（OSBP）相关蛋白（ORPs）是真核生物不可或缺的脂质转运体，也是药物和农用化学品开发的极具前景的靶标。在跨越生物界的ORP家族成员中，卵菌ORP1构成一个系统发育上独特的亚型，它在卵菌中独立进化，与动物、植物和真菌中的ORP同源物显著不同。氟噻唑吡乙酮（Oxathiapiprolin）是首个靶向OSBP家族蛋白的商业杀菌剂，特异性作用于卵菌ORP1，并对多种疫霉（Phytophthora）病原菌和霜霉病表现出强大的抑制活性。然而，卵菌ORP1的分子功能和氟噻唑吡乙酮的抑制机制仍然知之甚少。在此，研究人员证明大豆疫霉（Phytophthora sojae）的PsORP1特异性定位于内质网–高尔基体膜接触位点（MCSs），并且对大豆疫霉的营养生长和无性/有性发育不可或缺。体外脂质体重建实验证实，PsORP1保守的C端OSBP相关结构域（ORD）介导经典的磷脂酰丝氨酸（PS）/磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）反向转运。生化结合实验进一步证实，氟噻唑吡乙酮直接与PsORP1的ORD相互作用，并竞争性阻断PS/PI4P脂质交换。总之，这项研究表明PsORP1定位于ER–高尔基体MCSs，并介导ORD依赖的PS/PI4P反向转运，这对大豆疫霉发育至关重要；同时阐明氟噻唑吡乙酮直接靶向ORD以竞争性阻断该脂质交换，为合理设计下一代靶向OSBP的卵菌抑制剂提供了结构框架。
论文解读
脂质在真核细胞中承担结构组分、能量储存和信号调控等多种必需功能。从内质网（endoplasmic reticulum, ER）到细胞内各目的地的脂质运输可由囊泡和非囊泡机制介导，其中非囊泡转运主要依靠脂质结合/转运蛋白（lipid-binding/transfer proteins, LTPs）在膜接触位点（membrane contact sites, MCSs）完成。MCSs是两个细胞器膜紧密并列、间隔约10–30 nm的特化区域。氧甾醇结合蛋白（oxysterol-binding protein, OSBP）相关蛋白（OSBP-related proteins, ORPs）是一类进化上保守的LTP家族，其成员共享一个可结合胆固醇、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）及磷脂酰肌醇多磷酸（phosphoinositide phosphates, PIPs）的OSBP相关结构域（OSBP-related domain, ORD）。某些长链ORP还含有FFAT基序（两个苯丙氨酸后接一段酸性序列，可与ER上的VAMP受体结合）和N端PH结构域（pleckstrin homology domain，结合磷酸肌醇），从而介导ER与其他富含PIP的细胞器膜之间形成分子桥，完成非囊泡脂质转运。ORP功能失调与多种人类疾病有关，因此是药物和农用化学品开发的热门靶点。氟噻唑吡乙酮是首个商品化的靶向OSBP家族蛋白的杀菌剂，特异性作用于卵菌ORP1，对多种疫霉和霜霉病具有强效抑制活性，但卵菌ORP1的分子功能和氟噻唑吡乙酮的精确抑制机制此前尚不清楚。该论文发表在《Molecular Plant Pathology》。
研究人员以大豆疫霉野生型菌株P6497为材料，围绕卵菌ORP1展开研究。他们利用了以下关键技术方法：一是采用Tet-on/CRISPR-Cas9诱导表达系统，将PsORP1天然启动子替换为可诱导启动子，实现目的基因的可控沉默与回补；二是通过共聚焦荧光显微镜和人工构建的MCS报告蛋白PH-FFAT-mCherry进行亚细胞定位和共定位分析；三是使用微量热泳动（microscale thermophoresis, MST）和脂质斑点杂交（lipid dot-blot）检测ORD与不同脂质的结合亲和力；四是利用基于FRET的体外脂质体转运实验，定量评估PS和PI4P的转运及反向交换活性；五是构建PS或PI4P结合位点点突变体，并在诱导表达背景下进行回补实验；六是在活体层面使用PS传感器Lact-C2-GFP和PI4P传感器2×PH
FAPP1-GFP，结合氟噻唑吡乙酮处理，观察药物对脂质转运的影响。
结果部分包含四个主要发现。
2.1 PsORP1对大豆疫霉的生存至关重要
研究人员尝试利用常规CRISPR/Cas9敲除PsORP1，但未获得纯合突变体；随后使用Tet-on/CRISPR-Cas9诱导表达系统获得了三个转化体。在不添加诱导物多西环素（doxycycline, Dox）时，PsORP1沉默效率超过90%，菌丝生长严重受抑，抑制率超过90%，并且不能产生孢子囊、游动孢子和卵孢子。添加Dox后，PsORP1表达恢复至正常水平的约40%，菌丝生长以及无性/有性生殖相关表型得到部分恢复，其中游动孢子产量在所有三个转化体中恢复至野生型水平。这表明PsORP1是大豆疫霉营养生长和无性/有性发育不可或缺的关键蛋白。
2.2 PsORP1特异性定位于ER–高尔基体MCSs
将PsORP1-GFP与高尔基体标记MAN-mCherry、ER标记Sec61β-mCherry等共表达，发现PsORP1与ER和高尔基体存在部分共定位。进一步使用ER–高尔基体MCS报告蛋白PH-FFAT-mCherry进行共定位分析，确认全长PsORP1显著富集于ER–高尔基体MCSs。引人注意的是，缺失ORD的截短突变体PsORP1ΔORD仍能与MCS报告蛋白共定位，表明PsORP1的MCS定位并不依赖ORD，而可能由其他结构域（如N端PH结构域和独特的START结构域）介导。
2.3 PsORP1的ORD介导PS/PI4P反向转运
研究人员纯化了PsORP1的重组ORD，通过MST和脂质斑点杂交发现其能结合PS、PI4P、PI(3,4)P2、PI(4,5)P2和PI(3,4,5)P3。序列比对显示，在其他同源蛋白中负责识别PI4P和PS的氨基酸残基簇在PsORP1的ORD中保守。将PS结合位点突变（ORD
M-PS，L656D, K713/N716A）后，其对PS的亲和力下降超过100倍；将PI4P结合位点突变（ORD
M-PI4P，H740/741/K936A）后，解离常数从4.7 μM升至38.2 μM。在PsORP1诱导表达背景下，携带这些点突变的PsORP1均无法回复表型缺陷，证明ORD介导的脂质结合对PsORP1功能不可或缺。体外脂质体转运实验进一步表明，ORD能在脂质体间转运PS和PI4P，且一种脂质的存在能显著促进另一种脂质的转运，即具有反向交换活性，说明PsORP1是一种脂质交换因子。
2.4 氟噻唑吡乙酮破坏ORD依赖的PS和PI4P转运
MST实验显示，氟噻唑吡乙酮存在时，ORD对PS和PI4P的结合均受到削弱。体外脂质转运实验证实，药物处理显著降低ORD介导的PS和PI4P转运效率。在活体层面，研究人员将GFP标记的PS
