《Molecular Plant Pathology》：The Conserved Guanyl-Specific Ribonuclease T1 Effector EC19 Is Required for Full Virulence of the Vascular Wilt Fungus Fusarium oxysporum on Tomato
编辑推荐：
植物病原真菌分泌大量效应蛋白进入宿主细胞，通过干扰宿主正常生理过程促进侵染，然而鸟苷特异性核糖核酸酶T1（guanyl-specific ribonuclease T1）类效应蛋白在真菌病原毒力中的作用大多未被探索。研究人员发现，由引起番茄枯萎病的土传真菌番茄
植物病原真菌分泌大量效应蛋白进入宿主细胞，通过干扰宿主正常生理过程促进侵染，然而鸟苷特异性核糖核酸酶T1（guanyl-specific ribonuclease T1）类效应蛋白在真菌病原毒力中的作用大多未被探索。研究人员发现，由引起番茄枯萎病的土传真菌番茄专化型镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici，Fol）分泌的效应蛋白EC19有助于Fol的完全毒力。原位敲除EC19显著削弱Fol毒力，而在敲除突变体中回补EC19可恢复Fol对番茄的致病性。EC19含有核糖核酸酶T1样结构域，在真菌物种中高度保守，并能切割从番茄分离的单链RNA。EC19在Fol侵染期间被特异性诱导。AlphaFold3预测的EC19结构与米曲霉（Aspergillus oryzae）核糖核酸酶T1结构高度相似，与RNase T2相似性有限。利用农杆菌（Agrobacterium）介导在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中的瞬时表达实验，研究人员发现EC19主要定位于植物细胞细胞核。稳定遗传的过表达EC19的易感番茄植株较野生型对Fol侵染感病性增强。对EC19过表达番茄株系的RNA-seq分析显示，下调的差异表达基因主要富集于植物激素信号转导、苯丙烷生物合成及植物-病原互作途径。综上，这些发现表明具有核糖核酸酶活性的EC19促进Fol侵染，拓展了人们对Fol毒力分子机制的理解。
研究背景与立项依据
番茄枯萎病由土传病原真菌番茄专化型镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici，Fol）引起，是全球番茄生产的重要威胁。Fol经根入侵后定殖木质部导管，阻断水分与养分运输，导致萎蔫、黄化与死株。植物已演化出物理屏障与多层免疫应答，而病原真菌则分泌细胞壁降解酶（cell wall-degrading enzymes，CWDEs）与效应蛋白抑制免疫。核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）按底物特异性分RNase A、RNase T1与RNase T2三大家族；其中RNase T2家族成员（如FocRnt2、FoRnt2、Zt6、SRE1、Fg12）已被报道参与多种病原真菌毒力，但分泌型RNase T1家族蛋白在病原真菌毒力中的角色长期未被阐明。前期工作提示Fol候选效应蛋白EC19带功能性信号肽且全长可诱导本氏烟叶片细胞死亡，但其毒力功能未知。为此，研究人员在《Molecular Plant Pathology》报道的工作中系统鉴定EC19是否为Fol完全毒力所需效应蛋白及其作用方式。
主要技术方法概览
研究人员以番茄品种Moneymaker与Fol007（race 2，携Avr2/Avr3）及本氏烟为材料；通过同源重组与原生质体转化获得EC19原位敲除突变体（ΔEC19）及回补株系，以根浸法接种10日龄番茄苗评估病指与地上鲜重；从大肠杆菌Rosetta2（DE3）表达带N端10×His与C端Myc标签的EC19重组蛋白，以番茄总RNA为底物行体外RNase活性胶电泳检测；用BLASTp、ClustalW2、MEGA邻接法建系统树，AlphaFold3预测结构并以DALI（Z-score>2）比对米曲霉RNase T1（2RNT）与RNase T2（FG12）；RT-qPCR分析侵染期（2、4、6 dpi）根内EC19表达；农杆菌GV3101瞬时表达删信号肽的EC19-GFP，与核标记H2B-mCherry共定位 confocal 观测；遗传转化获35S驱动删信号肽EC19过表达番茄（EC19-OE）行表型与RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000，DESeq2筛|log2FC|>1且padj<0.05的DEGs，clusterProfiler做KEGG富集）。
研究结果
2.1 原位敲除EC19削弱Fol对番茄毒力
构建三个独立ΔEC19株系，菌落形态与野生型（WT）无差；根浸接种4周后WT番茄典型萎蔫，ΔEC19接种株生长如浇水对照，病指显著下降、地上鲜重与对照相当，证明EC19为Fol完全毒力所需。
2.2 回补EC19恢复ΔEC19突变体毒力
将EC19回补至ΔEC19-2获三个独立ΔEC19-2+C株系，EC19表达量同WT；回补株菌落正常，接种番茄后病状、病指、鲜重与WT无统计学差异，确认毒力丧失由EC19缺失导致。
2.3 EC19不参与Fol非生物胁迫耐受与产孢
在含1 M NaCl/KCl/山梨醇、0.02% SDS、0.02%刚果红（Congo red，CR）PDA上，ΔEC19-2与回补株菌落直径同WT；产孢量（PDA 7 d、NO3培养基5 d）亦无差，表明EC19专司毒力而非营养生长或胁迫适应。
2.4 EC19具RNase活性且在真菌中保守
纯化重组EC19降解番茄总RNA，效力同RNase A阳性对照，阴性缓冲不降解；BLASTp显示EC19同源序列广泛存在于镰刀菌属、Beauveria、Colletotrichum、Xylaria等真菌（含非致病F. oxysporum Fo47），均带Ribonuclease T1结构域；邻接树聚为高支持簇；AlphaFold3模型与米曲霉AoRnt1（PDB 2RNT）折叠高度保守，与RNase T2（FG12）低相似，确证其为功能性RNase T1。
2.5 EC19侵染期高诱导且定位于植物细胞核
RT-qPCR示EC19在分生孢子及体外培养（4–16 h）低表达，番茄根内2 dpi起升、6 dpi达峰；删信号肽EC19-GFP在本氏烟表皮细胞与H2B-mCherry共信号，主位于细胞核，提示分泌后可能再进入宿主核内。
2.6 EC19提升番茄对Fol感病性并重塑宿主转录
35S::EC19-OE番茄（删信号肽）无生长缺陷，但Fol007接种4周后病状更重、病指更高、鲜重更低；未接种OE株RNA-seq得225 DEGs（77上/148下），KEGG富集前位为植物激素信号转导、植物-病原互作、苯丙烷生物合成，六基因RT-qPCR验证一致，表明EC19通过压制防御与激素通路促侵染。
讨论与结论翻译
讨论指出，Fol效应库不限于致病染色体（chromosome 14/13上的SIX族），EC19定位于染色体12且于非致病Fo47保守，暗示其参与广布真菌定殖而非专化致病；EC19侵染期特异诱导受宿主信号调控的机制未明；RNase T1效应（EC19、Zt6、SRE1、Fg12）与RNase T2效应（FoRnt2、FocRnt2）均借RNA降解促毒力，但EC19是否胞外作用于质外体/木质部、或入胞降解核内RNA、或入根际行抗微生物以调控微生物组仍待厘定；稳定表达不致死而瞬时带肽表达致死的矛盾或源于定位、剂量与物种免疫差异。
研究结论：EC19是具有RNase T1活性的分泌型效应蛋白，于Fol侵染期高诱导、定位于宿主核，借降解宿主RNA与压制激素/苯丙烷/互作防御转录程序促进番茄枯萎病完全毒力；该蛋白跨真菌保守且非限于致病岛，拓宽了RNase T1家族作为真菌毒力效应蛋白的认知，为番茄抗Fol靶点挖掘提供新方向。
