DrdR通过与FleQ相互作用负调控野油菜黄单胞菌鞭毛基因的表达

《Molecular Plant Pathology》：DrdR Negatively Modulates the Expression of Flagellar Genes via Interaction With FleQ in Xanthomonas campestris

　　

含有串联接收（REC）结构域的双组分信号系统（TCSs）的响应调节子（RRs）在细菌中广泛存在，然而其功能和调控机制仍知之甚少。在研究人员的前期研究中，DrdR——十字花科黑腐病病原体野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc）中的此类RR之一——被证明正向调控菌毛依赖性运动性，并负向调控鞭毛依赖性运动性。研究人员发现，DrdR调节菌毛运动蛋白PilT和PilB的ATPase活性，从而增强细菌菌毛依赖性群集运动性。然而，DrdR如何抑制鞭毛运动性此前尚不清楚。在此，研究人员证明DrdR作为鞭毛基因表达的转录抑制因子发挥作用。研究人员利用体外和体内方法鉴定出鞭毛基因的主转录调控因子FleQ是DrdR的一个新型相互作用伙伴。生化分析表明，DrdR结合抑制FleQ的ATPase活性，而该活性对其转录激活功能至关重要。微量热泳动（MST）实验表明，DrdR降低FleQ与其同源启动子的DNA结合能力。这些发现共同表明，DrdR通过降低FleQ的DNA结合能力和ATPase活性来调节FleQ的转录活性。研究人员的结果证明，DrdR作为FleQ的特异性调节因子，在控制Xcc鞭毛基因表达的信号级联中上游发挥作用。该研究揭示了DrdR调节细菌运动性的一个先前未知的机制。结合研究人员此前的发现，这些数据表明DrdR很可能作为Xcc鞭毛依赖性运动性与菌毛依赖性运动性之间的转换调节因子发挥作用。

植物病原细菌在侵染、定殖和生存过程中需要感知环境并定向运动。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc）是十字花科黑腐病的致病菌，也是研究植物-微生物互作的重要模式菌。Xcc依赖极性鞭毛和IV型菌毛（T4P）进行运动，其中鞭毛运动对早期侵染至关重要。鞭毛基因表达受层级调控网络控制，涉及RpoD、RpoN2、FleQ和FliA等转录因子。FleQ是单鞭毛细菌中鞭毛合成基因的主调控因子，其缺失导致Xcc游动运动消失。然而，FleQ的活性如何被上游信号和蛋白因子调控，尤其在Xcc中尚不清楚。前期研究发现，一个由功能性REC结构域和催化失活REC结构域组成的特殊响应调节子（RR）DrdR，在Xcc中正调控菌毛依赖性群集运动、负调控鞭毛依赖性游动运动，但其抑制鞭毛运动的分子机制未知。基于此，研究人员开展了本研究。

研究人员综合运用转录组、分子生物学和生化分析手段，证明DrdR直接与FleQ互作，并通过抑制FleQ的ATPase活性和DNA结合能力来负调控鞭毛基因表达。该论文发表在《Molecular Plant Pathology》。该研究首次揭示了一种调控蛋白能同时调节FleQ的ATPase活性和DNA结合活性，并提出了DrdR作为鞭毛运动与菌毛运动之间转换开关的模型。

主要技术方法：研究以Xcc 8004菌株为材料，培养于NYG丰富培养基。采用RNA-seq转录组分析、反转录定量PCR（RT-qPCR）、启动子-β-葡萄糖醛酸酶（gusA）报告系统、Western blot分析FliC蛋白水平；利用细菌双杂交（B2H）和pull-down检测蛋白互作；通过凝胶迁移实验（EMSA）、微量热泳动（MST）和体外转录评估FleQ对fliE启动子的结合与激活；用孔雀绿法测定ATPase活性；并构建基因缺失、回补和点突变株（fleQE238A）进行表型验证。

研究结果包括以下几个部分：

2.1 DrdR Is Involved in the Expression of a Set of Genes Including Flagellar Genes：通过RNA-seq比较ΔdrdR与野生型，发现133个基因差异表达，其中82个上调、51个下调，功能分类显示多个鞭毛相关基因（flgB、fliE、flhB、motB）上调。RT-qPCR验证flgB、fliC、fliS、fliE、fliK、flhB在突变体中表达升高；启动子-gusA报告分析显示flgB、fliE、flhB启动子活性在drdR缺失背景下显著增强；Western blot显示FliC蛋白水平也升高。说明DrdR负调控鞭毛合成基因表达。

2.2 DrdR Interacts With FleQ and Acts Upstream of It in the Regulatory Pathway Controlling Swimming Motility：过表达fleQ使鞭毛基因表达和游动运动增强。B2H和体外pull-down证明DrdR可与FleQ直接结合。遗传上位分析显示，ΔdrdRΔfleQ双突变体的游动表型与ΔfleQ单突变体相同；回补fleQ可恢复运动性甚至达到ΔdrdR水平，而回补drdR不能恢复，说明DrdR对运动性的抑制依赖fleQ，DrdR位于FleQ上游。

2.3 DrdR Reduces the Ability of FleQ to Bind to and Activate Its Target Promoters：EMSA表明FleQ可特异结合fliE启动子，添加DrdR后FleQ-DNA复合物条带迁移减弱；MST测得FleQ与fliE启动子的解离常数K_d为232±48.56 nM，预